在科研和細(xì)胞工程等領(lǐng)域中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，經(jīng)常需要實(shí)現(xiàn)多個基因的穩(wěn)定共表達(dá)，目前常用的策略是多重感染、多重分離篩選等，然而這種方式存在很多弊端：①真核細(xì)胞中可使用的篩選標(biāo)記數(shù)量有限；②實(shí)驗(yàn)周期長；③同時使用多個不同的篩選基因可能對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響；④多基因串聯(lián)，病毒包裝效率低等；以上問題為篩選多基因共表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株在時間和成本等方面提出了挑戰(zhàn)。因此，有必要開發(fā)新的技術(shù)手段解決以上問題。?
維真生物建立了一種可簡單快速地實(shí)現(xiàn)多基因共表達(dá)的分裂篩選系統(tǒng)！? · ? ? 分裂篩選標(biāo)記原理? 研發(fā)路線 利用慢病毒快速構(gòu)建IPS穩(wěn)轉(zhuǎn)株 目前，我們已經(jīng)利用上述系統(tǒng)，成功獲得了共表達(dá)四種轉(zhuǎn)錄因子（Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4）的IPS穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。 ? 首先，我們將四種轉(zhuǎn)錄因子分成兩組分別構(gòu)建到前面所述的雙慢病毒載體中，得到pLent-Ef1a-Oct4-P2A-Sox2-cmv-N-Puro（簡稱IPS-N-Puro）和pLent-Ef1a-Klf4-P2A-Myc-cmv-C-Puro（簡稱IPS-C-Puro）的慢病毒質(zhì)粒。隨后將這兩個慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到293A細(xì)胞中，通過Puro篩選，觀察細(xì)胞生長情況。如下圖所示設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對照組，我們發(fā)現(xiàn)在Puro加壓后空細(xì)胞組細(xì)胞大量死亡，而實(shí)驗(yàn)組與對照組中細(xì)胞存活率較高。這一結(jié)果說明，有大量的雙慢病毒載體進(jìn)入了同一細(xì)胞中，抗生素基因得到了正常表達(dá)，大量細(xì)胞得以存活下來。 ?接著，我們將上述兩個慢病毒載體分別包裝成慢病毒，進(jìn)行293A細(xì)胞的共感染，如下圖所示設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，感染72小時后，加Puro進(jìn)行篩選，我們發(fā)現(xiàn)，空白組細(xì)胞（5）和單一慢病毒感染組（2、3）的細(xì)胞，出現(xiàn)大量死亡，而“攝取”到雙病毒的實(shí)驗(yàn)組（1）和GFP組（4），細(xì)胞存活率明顯高于兩病毒單獨(dú)感染組，在篩選一周后我們成功獲得了大量穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。 慢病毒 載體 滴度 IPS-N pLent-Ef1a-Oct4- 7.19E+08 IPS-C pLent-Ef1a-Klf4- 1.87E+09 ? 同樣地，我們對兩病毒共感染組與GFP慢病毒對照組中細(xì)胞中的四種轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的表達(dá)情況進(jìn)行了定量檢測，結(jié)果與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所得結(jié)果基本一致，兩病毒共感染組細(xì)胞中四種轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)量都要明顯高于GFP對照組，結(jié)果同樣驗(yàn)證了上述結(jié)論，四基因共表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞構(gòu)建成功。 ? ? 結(jié)語 維真生物成功建立了一種可實(shí)現(xiàn)分裂篩選標(biāo)記的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)，能夠利用一個篩選標(biāo)記選擇多個轉(zhuǎn)基因，使多基因的共同表達(dá)更加簡單方便，并能在短時間內(nèi)完成多基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建。目前，我們已經(jīng)利用該系統(tǒng)成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)四種轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。此外，該系統(tǒng)還可以在CRISPR/Cas9基因組編輯中，用于雙轉(zhuǎn)基因或雙等位基因敲除的陽性細(xì)胞選擇。歡迎各位老師垂詢！更多服務(wù)詳情，歡迎訪問官網(wǎng)www.wzbio.com.cn查詢【首頁-附加服務(wù)-分裂篩選標(biāo)記系統(tǒng)】
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P2A-Sox2-cmv-N-Puro
IU/ml
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P2A-Myc-cmv-C-Puro
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