篩靶就找達吉特。小分子藥物進行靶點篩選是進行小分子藥理解釋、小分子減毒增效改造乃至開發(fā)出新藥的重要基礎(chǔ)。中藥小分子往往被作為開發(fā)新藥的先導化合物，其普遍具有多靶點多功效的特性，找到并明確中藥小分子的藥效靶點對于新藥開發(fā)領(lǐng)域具有重要意義。達吉特在小分子靶點篩選實驗中，主要提供兩大類，一類是基于修飾策略的靶點篩選，主要是對小分子進行生物素或者炔基修飾；一類是非修飾策略。由于非修飾策略方案均受到結(jié)合原理的限制，目前以生物素標記和炔基標記的靶點篩選策略仍是小分子靶點發(fā)現(xiàn)的主流技術(shù)。下面就針對常用的八種靶點篩選方法進行詳細介紹。
方案一：基于生物素修飾--20K人類蛋白組芯片
技術(shù)原理：芯片上有超過2萬種人類全長蛋白質(zhì)，覆蓋81%的人類基因組ORF區(qū)，是目前世界上通量最高的蛋白質(zhì)芯片。將帶有生物素標記的小分子與20K芯片共同孵育，再引入帶有CY3或CY5熒光的鏈霉親和素，通過檢測芯片上的熒光信號，即可確定小分子的直接結(jié)合靶蛋白。相比于傳統(tǒng)靶點篩選技術(shù)，能夠獲取小分子的直接結(jié)合靶點蛋白，篩選更加高效和準確。此外，采用20K人類蛋白組芯片就進行靶點篩選，還能解決傳統(tǒng)方法中由于蛋白豐度低而難以捕捉的藥-靶結(jié)合問題。利用一次芯片實驗能夠確定多個小分子的直接結(jié)合靶點蛋白，具有極高的性價比，其技術(shù)優(yōu)勢不可替代。
方案二：基于生物素修飾--GPCR膜蛋白芯片
關(guān)于膜蛋白靶點篩選我們可以選用GPCR膜蛋白芯片。GPCR膜蛋白芯片是先在單純皰疹病毒（HSV-1）上表達GPCR，經(jīng)過宿主細胞的復制后，將病毒粒子純化出來點制在三維立體修飾的芯片片基上，因此GPCR膜蛋白在病毒磷脂雙分子層的支持下可保持完整的活性結(jié)構(gòu)。這種方法消除了使用傳統(tǒng)方法研究GPCR膜蛋白時引起的內(nèi)源性細胞受體的問題，避免了基于細胞的結(jié)合分析限制，并且能夠展現(xiàn)出更清晰的數(shù)據(jù)。目前該芯片上共包含400多種常見藥靶膜蛋白。GPCR膜蛋白芯片進行靶點篩選能夠篩選到直接結(jié)合的膜蛋白靶點，假陽性率較低；且采用熒光檢測結(jié)合反應，檢測靈敏度更高。
方案三：基于生物素修飾--Pull down+MS
小分子靶點篩選的Pull down實驗是一種有效的篩選藥物與潛在靶蛋白之間相互作用的體外技術(shù)。利用生物分子之間的親和力原理，將生物素標記的小分子化合物固定在鏈霉親和素的磁珠上，與蛋白裂解液進行孵育，孵育結(jié)束后與小分子結(jié)合的蛋白可以通過質(zhì)譜檢測，將下游的靶點蛋白鑒定出來。該方法簡單易行，操作方便，在藥靶篩選方面已得到廣泛的應用。
方案四：基于炔基修飾--ABPP基于炔基標記的點擊化學技術(shù)
ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是在點擊化學和LC-MS質(zhì)譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的小分子化合物靶點篩選技術(shù)。將小分子進行炔基標記后處理細胞，通過簡便高效的點擊化學反應，將結(jié)合上靶點蛋白的炔基小分子連接到帶有疊氮的磁珠上，通過磁珠離心獲取小分子靶向結(jié)合的靶點蛋白。進一步，通過LC-MS分析出小分子的潛在靶點蛋白。ABPP的獨特技術(shù)特點在于炔基修飾對小分子的活性和結(jié)構(gòu)影響低，可以在活細胞水平上進行靶點篩選，更接近真實的生物學條件。
方案五：基于生物素修飾--SPIDER基于鄰近標記技術(shù)的膜蛋白靶點篩選
SPIDER技術(shù)的原理基于結(jié)核分枝桿菌類泛素蛋白酶體系統(tǒng)中底物Pup分子在體外能夠招募PafA連接酶發(fā)揮鄰近標記作用。將小分子進行生物素標記后處理活細胞，加入SPIDER 系統(tǒng)，在結(jié)核分枝桿菌類泛素化連接酶PafA的催化下，PupE的C末端與靶蛋白表面的賴氨酸殘基共價相連，形成類泛素連接反應，進一步，通質(zhì)譜分析出小分子的潛在靶點蛋白。
該技術(shù)十分適用于篩選小分子的膜蛋白靶點篩選，主要是因為該技術(shù)能夠在活細胞水平上進行靶點篩選，從而保證膜蛋白的活性和構(gòu)象；此外該技術(shù)可以將小分子與互作蛋白轉(zhuǎn)為共價結(jié)合，形成類泛素化連接反應，牢牢抓住小分子與膜蛋白結(jié)合的信息，這也使得后續(xù)可以使用嚴苛的洗脫條件從而有效降低非特異性干擾，使得結(jié)果更靈敏、更特異、更穩(wěn)定。
方案六：非修飾策略--DARTS藥物親和反應靶向穩(wěn)定性技術(shù)
DARTS技術(shù)是基于蛋白的酶解穩(wěn)定原理，即小分子與蛋白結(jié)合后，可能使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋或聚集，從而使蛋白對廣譜的蛋白酶變得更加耐受或敏感。通過SDS-PAGE分離，進行實驗組和對照組的條帶比較，最后進行質(zhì)譜鑒定，即可得到小分子的潛在靶點蛋白。該方法操作簡便，可適用于大多數(shù)小分子化合物，同時適用于復方、混合物以及菌種等體系的靶點篩選。但是由于其技術(shù)原理的限制，不適用于在自然條件下抵抗蛋白質(zhì)水解的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
方案七：非修飾策略--LiP-MS限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)
該技術(shù)是一種基于有限蛋白酶切的化合物靶點篩選技術(shù)，其獨特之處在于無需對化合物進行修飾即可實現(xiàn)對特定化合物結(jié)合肽段進行篩選。小分子與靶點蛋白結(jié)合后，會形成空間位阻，防止蛋白酶K等廣譜蛋白酶對靶點蛋白特定多肽位點的水解。進一步利用胰酶在精氨酸和賴氨酸特定位點消化所有蛋白質(zhì)后再進行質(zhì)譜檢測。通過對蛋白酶K和胰酶切割差異化位點的分析，可以找到小分子作用的差異性肽段。基于技術(shù)原理，LiP-MS技術(shù)更適用于小分子量代謝產(chǎn)物的靶點篩選研究。
方案八：非修飾策略--CETSA細胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)
該技術(shù)基于蛋白的熱穩(wěn)定性原理進行靶點篩選，即小分子與靶點蛋白結(jié)合后會增強靶點蛋白的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的升高，部分蛋白會逐漸降解。相同溫度下，結(jié)合了藥物的蛋白質(zhì)具有更高的熱穩(wěn)定性，相比未結(jié)合藥物的蛋白質(zhì)，未降解蛋白的量會提高，同時該復合蛋白的熱熔曲線發(fā)生改變，進一步通過質(zhì)譜鑒定到小分子的潛在靶點蛋白。由于其技術(shù)原理的限制，不適用于在自然條件下不受溫度影響的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。該技術(shù)也是目前非修飾策略技術(shù)中靈敏度最高一個靶點篩選技術(shù)。
以上就是所有靶點篩選技術(shù)的整體介紹，每個技術(shù)都有各自的優(yōu)勢，可以依據(jù)自己的需求進行選擇。如有需求歡迎訪問達吉特官網(wǎng)www.tgtmed.com做進一步咨詢！