基于活性的蛋白質組學分析技術（Activity-Based Protein Profiling，ABPP）是在活性化合物探針與蛋白質組學技術基礎上發展而來的小分子釣靶技術。隨著科學技術的迅速發展，高通量質譜和點擊化學（Click Chemistry）的融合極大提高了分析的靈敏度、分辨率以及化合物探針的生物相容性。基于炔基或光交聯基團標記的ABPP技術目前被廣泛應用于化合物結合靶蛋白的篩選與鑒定，為闡明活性化合物的作用機制提供了關鍵助力。
圖1 ABPP技術實驗流程圖
半胱氨酸作為蛋白質組中功能極為重要的氨基酸，具有高反應性和多功能特性，能夠參與如酶的催化和變構調控等多種生物學過程。由于其高反應性，半胱氨酸已成為共價藥物設計的理想結合位點。由此，鑒定小分子化合物在細胞內結合靶蛋白的半胱氨酸位點，在藥物靶點發現、先導化合物優化和基礎生物學機制研究中具有重要作用。近年來，針對蛋白質半胱氨酸鑒定的ABPP技術層出不窮。
isoTOP-ABPP技術
2010年，來自斯克利普斯研究所的Benjamin F. Cravatt研究團隊于《Nature》發表了一項題為“Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes”的研究。該研究在ABPP技術的基礎上開發了一種競爭性活性導向蛋白質分析方法——基于同位素標記串聯正交酶水解的活性蛋白質分析技術（isotopic Tandem Orthogonal Protease-activity-based Protein Profiling，isoTOP-ABPP）。首先被應用于在全蛋白質組范圍內定量分析半胱氨酸的反應活性。
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isoTOP-ABPP技術中設計了一種獨特的探針結構：炔基化的碘乙酰胺（IA-Alkyne）。將其處理蛋白質組樣本后，IA（碘乙酰胺）能夠與活性半胱氨酸殘基發生共價結合（本質是半胱氨酸巰基（-S?）對碘乙酰胺 α-C 的 S?2 親核取代反應）。隨后，引入同位素標簽“輕（Light）”“重（Heavy）”以區分實驗組與對照組。再通過點擊化學將帶有疊氮基團的富集標簽（Azide-TEV-Biotin）鏈接到活性探針的炔基基團（該標簽包括：疊氮Azide：與炔基發生點擊化學反應；生物素Biotin：用于鏈霉親和素磁珠的富集；TEV蛋白酶酶切位點：用于后續的特異性酶解釋放）。利用鏈霉親和素磁珠處理樣品，再利用TEV蛋白酶進行處理，釋放出被標記半胱氨酸的肽段，更利于后續的質譜鑒定。最后，通過質譜分析，比較輕/重同位素信號的比率（Ratio），就能夠精確判斷出具有反應性的半胱氨酸位點。
圖2 isoTOP-ABPP技術實驗流程導圖
在此基礎上，該團隊在2013年于《Nature Methods》發表了題為“A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles”的另一研究。在該研究中，團隊利用“競爭性結合”這一概念，通過對比分析小分子化合物與探針作用后標記信號的改變，來鑒定小分子在細胞中與靶蛋白結合的具體半胱氨酸位點。
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不同于之前技術中化合物對蛋白質的直接標記，競爭性isoTOP-ABPP先將待研究的小分子化合物處理實驗組樣品，用等量的對照溶劑處理對照組樣品。隨后在兩組中分別加入IA-Alkyne探針進行競爭標記。最后，通過點擊化學反應及質譜分析，比較實驗組與對照組樣品，其中標記信號顯著降低的位點即是小分子化合物的潛在結合位點。
isoTOP-ABPP技術作為一種“發現”工具，能夠全局性、無偏倚地繪制化合物在整個蛋白質組中所有反應性半胱氨酸的活性圖譜。
競爭性isoTOP-ABPP作為一種“篩選”工具，能夠精準鑒定小分子化合物在復雜蛋白質組中結合靶蛋白的具體半胱氨酸位點，對于理解藥物作用機制和挖掘潛在副作用具有關鍵作用。此外，還能夠定量比較同一化合物對于不同靶點結合位點的占據效率，以評估其選擇性，為結構優化提供指導。
近年來，隨著相關研究的推進，國際頂級期刊中采用該技術開展的研究越來越多，其應用場景也愈發廣泛。在這里，小編按照時間順序整理了3篇發表于CNS正刊中應用isoTOP-ABPP技術的研究文章，和大家一起學習。（更多相關文獻見文末列表）
01 系統性鑒定抗癌藥物靶點，揭示細胞核-線粒體ROS感應通路
2023年5月15日，哈佛大學醫學院的研究團隊在《Cell》上發表了題為“Systematic identification of anticancer drug targets reveals a nucleus-to-mitochondria ROS-sensing pathway”的研究文章。
技術目的：該研究整合活性蛋白組學及基因篩選等技術，對11種抗癌藥物誘導ROS產生的內在機制展開研究。利用isoTOP-ABPP技術全局性、無偏向地發現和定量細胞內成千上萬個半胱氨酸殘基在抗癌藥物處理后的反應性變化。該技術能夠盡可能的捕獲半胱氨酸多種修飾類型（包括氧化、化合物直接修飾、ROS相關代謝物加合），還能反映初級和次級ROS活性效應。
技術應用與結果：在鑒定出的35656個半胱氨酸和8297個蛋白質中，發現2910個蛋白質中的4980個半胱氨酸存在反應性變化（與載體對照相比，iso-TMT比率（R）顯示反應性變化≥1.5倍的半胱氨酸）。根據反應性變化模式將半胱氨酸分為4個簇進行特征分析（圖3A-B），并通過新開發的“半胱氨酸反應性評分”發現多種抗癌藥物誘導的半胱氨酸靶點（圖3C-D），為理解藥物機制和開發新療法提供了關鍵數據支持。
圖3 系統性鑒定抗癌藥物靶點，揭示細胞核-線粒體ROS感應通路
02 蛋白質組全范圍鑒定破譯甲醛作用——作為信號傳導劑對于生物合成與一碳代謝的調控作用
2023年11月2日，美國加州大學伯克利分校的研究團隊在《Science》上發表了題為“Formaldehyde regulates S-adenosylmethionine biosynthesis and one-carbon metabolism”的研究文章。
技術目的：該研究發現了甲醛（FA）與S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）作為細胞中的一碳單位參與代謝與表觀遺傳調控的重要作用。利用isoTOP-ABPP技術分析發現甲醛能夠特異性且選擇性地修飾蛋白質組中特定的半胱氨酸殘基。甲醛作為一種選擇性親電信號分子，通過劑量依賴性方式，特異性結合 SAM 合成終末酶（MAT1A）的Cys120位點，抑制SAM生成并降低細胞甲基化潛力。該研究揭示甲醛可通過位點特異性翻譯后修飾調控細胞核心代謝，為理解一碳單位間的相互作用及相關疾病機制提供了新的視角。
技術應用與結果：研究者使用接近疾病水平濃度的甲醛處理小鼠脾臟裂解液，通過isoTOP-ABPP鑒定出576個對甲醛高度敏感的半胱氨酸位點（圖4A-B），進一步分析得知，這些被甲醛修飾的蛋白質并非隨機分布，而是顯著富集于與甲醛代謝和一碳代謝相關的關鍵通路中（圖4C-D）。證實甲醛應被視為一種選擇性親電信號分子，而非非特異性損傷劑，它通過修飾特定功能通路（尤其是一碳代謝）中的關鍵半胱氨酸殘基來可能調控細胞功能。
圖4 蛋白質組全范圍鑒定破譯甲醛作為信號傳導劑，對于生物合成與一碳代謝的調控作用
03 DrugMap：跨癌癥研究中全面鑒定半胱氨酸可配體結合性
2024年4月22日，麻省總醫院癌癥中心的研究團隊在《Cell》上發表了題為“DrugMap: A quantitative pan-cancer analysis of cysteine ligandability”的研究文章。
技術目的：isoTOP-ABPP技術已推動針對多種癌癥半胱氨酸靶點的共價抑制劑分子的研發。然而不同致癌背景如何影響半胱氨酸的靶向性仍不明確。由此，研究者開發了一份涵蓋416種癌細胞系的半胱氨酸可配體結合性圖譜——“DrugMap”，并在此基礎上揭示了不同癌癥間半胱氨酸可配體結合性的異質性，明確了驅動半胱氨酸靶向性的細胞內在特征，并為利用共價探針破壞致癌轉錄因子活性提供了實踐范例。
技術應用與結果：研究者為繪制跨多種癌癥的半胱氨酸可配體性綜合圖譜，選擇了來自25種癌癥亞型（譜系）的416種細胞系，每個譜系平均由約18個細胞系代表，較罕見的癌癥也至少由兩個細胞系覆蓋（圖5A）。隨后利用isoTOP-ABPP與串聯質譜標簽（TMT）技術相結合，測量半胱氨酸的反應性。結果共定量了78523個半胱氨酸，發現其中5957個具有可配體性（圖5B）。進一步，將數據與多組學信息進行整合，并通過新開發的計算工具——半胱氨酸集富集分析（CSEA）進行深入挖掘，最終形成了一個多維度、可交互探索的研究平臺“DrugMap”，為揭示跨癌癥的豐富而詳細的半胱氨酸可配體研究提供了數據支撐，也為未來開發癌癥靶向藥物提供了可行可用的全新策略（圖5C）。
圖5 DrugMap：跨癌癥研究中全面鑒定半胱氨酸可配體結合性
總結與討論
isoTOP-ABPP技術作為ABPP技術的一個重大發展，用于在全蛋白質組范圍內定量分析藥物作用后半胱氨酸的反應活性，極大地推動了藥物靶點發現、藥物結合半胱氨酸位點鑒定、全局性地分析藥物-蛋白質相互作用圖譜，為基礎生物學功能研究、發現生物標志物以及藥物選擇性和結構優化提供重要指導。
在此基礎上，更多的研究者利用不同的探針或質譜方法，開發出了新的反應試劑和分析方法來克服isoTOP-ABPP技術本身存在的一些局限性，使其應用于更加廣泛的研究場景。例如北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命聯合中心王初課題組研究發展的具有高選擇性和定量準確性三重定量化學蛋白質方法（rdTOP-ABPP）、具有重現性好，覆蓋度高，定量準確等優勢的無標記定量化學蛋白質組學方法（DIA-ABPP）等。
近十年里，隨著化學蛋白質組學的迅猛發展，越來越多的ABPP衍生技術被應用于基礎生物學、藥物發現和精準醫療等多個領域。在推動共價藥物發展的同時，在蛋白質組學研究中也為我們提供了前所未有的視角。受篇幅限制，達吉特只能列舉幾篇經典案例，其實isoTOP-ABPP以及以競爭ABPP技術為底層技術所發表的頂級刊物文章還有很多，說明ABPP化學蛋白組及其衍生技術的準確性和適用范圍非常廣泛，受到業界普遍關注和認可。
達吉特已經合成了數百種炔基和光交聯基團標記的小分子，可以支持研究人員在各類細胞中利用ABPP和isoTOP-ABPP技術快速釣取疾病相關特異性功能靶點。
相關文獻
1.Weerapana E, Wang C, Simon GM, et al. Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes. Nature. 2010;468(7325):790-795. doi:10.1038/nature09472
2.Wang C, Weerapana E, Blewett MM, Cravatt BF. A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles. Nat Methods. 2014;11(1):79-85. doi:10.1038/nmeth.2759
3.Zhang J, Simpson CM, Berner J, et al. Systematic identification of anticancer drug targets reveals a nucleus-to-mitochondria ROS-sensing pathway. Cell. 2023;186(11):2361-2379.e25. doi:10.1016/j.cell.2023.04.026
4.Pham VN, Bruemmer KJ, Toh JDW, et al. Formaldehyde regulates S-adenosylmethionine biosynthesis and one-carbon metabolism. Science. 2023;382(6670):eabp9201. doi:10.1126/science.abp9201
5.Takahashi M, Chong HB, Zhang S, et al. DrugMap: A quantitative pan-cancer analysis of cysteine ligandability. Cell. 2024;187(10):2536-2556.e30. doi:10.1016/j.cell.2024.03.027
6.Vinogradova EV, Zhang X, Remillard D, et al. An Activity-Guided Map of Electrophile-Cysteine Interactions in Primary Human T Cells. Cell. 2020;182(4):1009-1026.e29. doi:10.1016/j.cell.2020.07.001
7.Backus KM, Correia BE, Lum KM, et al. Proteome-wide covalent ligand discovery in native biological systems. Nature. 2016;534(7608):570-574. doi:10.1038/nature18002
8.Yang F, Gao J, Che J, Jia G, Wang C. A Dimethyl-Labeling-Based Strategy for Site-Specifically Quantitative Chemical Proteomics. Anal Chem. 2018;90(15):9576-9582. doi:10.1021/acs.analchem.8b02426
9.Qin W, Qin K, Zhang Y, et al. S-glycosylation-based cysteine profiling reveals regulation of glycolysis by itaconate. Nat Chem Biol. 2019;15(10):983-991. doi:10.1038/s41589-019-0323-5
10.Yang F, Jia G, Guo J, Liu Y, Wang C. Quantitative Chemoproteomic Profiling with Data-Independent Acquisition-Based Mass Spectrometry. J Am Chem Soc. 2022;144(2):901-911. doi:10.1021/jacs.1c11053
達吉特針對中藥及小分子藥物研究，建立了一套完整的技術服務體系：
1）中藥/復方的有效成分高標準鑒定
2）空間藥物分布與空間藥代動力學
3）小分子化合物批量標記（生物素/炔基/熒光）
4）小分子釣靶（標記法）：20K人類蛋白組芯片/ ABPP/競爭性化學蛋白組
5）小分子釣靶（非標記法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA
6）膜蛋白靶點篩選技術：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片
7）藥物調控通路篩選：磷酸化抗體芯片/磷酸化蛋白組
8）SPR表面等離子共振（分子動力學）
9）藥-靶結合位點分析（高分辨質譜/分子對接）
10）細胞、小動物活體成像
11）表型篩藥：Drug-seq分子表型篩藥、類器官篩藥、高內涵篩藥
12）以靶找藥：虛擬篩選+HSPR