去甲腎上腺素（Norepinephrine, NE）是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的一種至關(guān)重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。在大腦中，NE主要由藍(lán)斑（Locus coeruleus，LC）的神經(jīng)元產(chǎn)生，NE能神經(jīng)元廣泛投射到整個(gè)大腦，影響警覺性、覺醒狀態(tài)以及學(xué)習(xí)和記憶等過程。此外，NE還參與調(diào)節(jié)心率、血壓等自主功能，以及應(yīng)對(duì)壓力的生理反應(yīng)。在臨床上，NE的異常釋放與多種精神和神經(jīng)性疾病的發(fā)展有關(guān)，如抑郁癥、注意力缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）和焦慮癥等。因此，在活體動(dòng)物中以高靈敏度和高時(shí)空分辨率監(jiān)測(cè)NE的動(dòng)態(tài)變化對(duì)解析NE參與生理及病理過程的機(jī)制至關(guān)重要。盡管此前由李毓龍教授的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的第一代可遺傳編碼的NE探針首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)NE的檢測(cè)，但其有限的靈敏度和信噪比使得在體應(yīng)用存在諸多障礙。
2024年3月27日，北京大學(xué)李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Neuron雜志在線發(fā)表了題為Monitoring norepinephrine release in vivo using next-generation GRABNE sensors的研究論文。該研究基于GRAB探針策略（GPCR-Activation Based Sensor），成功優(yōu)化了二代綠色熒光NE探針，并構(gòu)建了一個(gè)新型的Cre依賴型雙熒光探針表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，實(shí)現(xiàn)了在活體小鼠的多個(gè)腦區(qū)和多種行為范式下，同時(shí)且可靠地檢測(cè)NE和鈣信號(hào)。
第二代去甲腎上腺素?zé)晒馓结?/p>
通過改造G蛋白偶聯(lián)受體和循環(huán)重排的綠色熒光蛋白，優(yōu)化的第二代NE熒光探針（包括中等親和力版本的GRABNE2m和高等親和力版本的GRABNE2h）在離體HEK細(xì)胞與原代神經(jīng)元中表現(xiàn)出比第一代探針更高的靈敏度。令人振奮的是，在離體系統(tǒng)中對(duì)探針信號(hào)的優(yōu)化成功地在活體檢測(cè)系統(tǒng)中得到證實(shí)，優(yōu)化的第二代NE熒光探針在檢測(cè)由光遺傳學(xué)和行為學(xué)刺激觸發(fā)的藍(lán)斑和外側(cè)下丘腦（Lateral Hypothalamus，LH）中NE釋放時(shí)，顯示出高于一代NE探針5倍的熒光信號(hào)變化。此外，由于NE和另一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（Dopamine, DA）在結(jié)構(gòu)上的差異僅為一個(gè)羥基，傳統(tǒng)的活體檢測(cè)方法通常難以區(qū)分它們。幸運(yùn)的是，二代NE熒光探針對(duì)NE表現(xiàn)出較高的分子選擇性。研究表明，在小鼠體內(nèi)，GRABNE2m可以檢測(cè)到光遺傳學(xué)刺激下神經(jīng)元釋放的NE，而無法檢測(cè)到DA，進(jìn)一步證明了該探針在精確檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)方面的巨大潛力。
該研究不僅僅局限于探針的開發(fā)。研究團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建了一種新型的Cre依賴型轉(zhuǎn)基因小鼠品系，能夠利用Cre-LoxP系統(tǒng)表達(dá)兩種熒光探針（綠色熒光GRABNE2m和紅色熒光鈣探針jRGECO1a）。結(jié)合標(biāo)記不同細(xì)胞類型的Cre病毒或Cre轉(zhuǎn)基因鼠，這一工具鼠可實(shí)現(xiàn)雙色成像，同時(shí)且更為可靠地監(jiān)測(cè)NE和鈣信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化，將有機(jī)會(huì)為不同生理狀態(tài)下的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制提供全新的見解。利用雙色光纖記錄和介觀大視場(chǎng)成像技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)還揭示了在睡眠覺醒、感覺處理和運(yùn)動(dòng)過程中，活體小鼠中NE和鈣的細(xì)胞類型特異的時(shí)空動(dòng)態(tài)。這項(xiàng)研究揭示了在不同生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)具有多樣化的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制。
綜上所述，北京大學(xué)李毓龍教授課題組開發(fā)的第二代去甲腎上腺素?zé)晒馓结槪℅RABNE2m和GRABNE2h）憑借其高靈敏度和優(yōu)異的選擇性，為在活體條件下對(duì)NE的監(jiān)測(cè)提供了更加準(zhǔn)確的工具。通過構(gòu)建的新型Cre依賴型轉(zhuǎn)基因小鼠品系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)NE和鈣信號(hào)的雙色成像與同步監(jiān)測(cè)。李毓龍教授課題組的新成果為將來研究去甲腎上腺素神經(jīng)調(diào)控及其對(duì)行為和神經(jīng)障礙影響奠定了基礎(chǔ)。有了這些先進(jìn)的工具，研究人員能夠更好地監(jiān)測(cè)和解讀實(shí)時(shí)變化的神經(jīng)遞質(zhì)復(fù)雜活動(dòng)，為我們理解大腦功能開辟了新的疆域。
北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馮杰思博士為本文第一作者，李毓龍教授和馮杰思博士為共同通訊作者，李毓龍課題組董輝博士（現(xiàn)為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院松江研究院青年研究員）、鄧飛博士（現(xiàn)為深圳灣實(shí)驗(yàn)室分子生理學(xué)研究所博士后）、王歡博士、李國(guó)川、蔡儒儀等對(duì)文章做出了重要貢獻(xiàn)。該工作得到了紐約大學(xué)林大宇研究組、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院崔國(guó)紅研究組及清華大學(xué)自動(dòng)化系謝浩博士、莊超瑋博士等的通力合作。