01 研究背景
已有大量研究試圖通過單核RNA測序來揭示人類心臟的細(xì)胞異質(zhì)性，但由于轉(zhuǎn)錄因子檢測的局限性，心臟轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)尚未被系統(tǒng)的描述。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院胡盛壽院士、李向杰副研究員和宋江平教授共同通訊在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF 40.8)上發(fā)表文章“PBX/Knotted 1 homeobox-2 (PKNOX2) is a novel regulator of myocardial fibrosis”，研究開發(fā)了一個強(qiáng)大的無偏倚的組織處理和單核轉(zhuǎn)錄組分析管道，提高了更多的轉(zhuǎn)錄因子和參與信號通路的基因的檢測；并表征了健康心臟的細(xì)胞組成，確定了主要決定細(xì)胞亞型身份和功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中一種新的調(diào)節(jié)因子PKNOX2被證明在成纖維細(xì)胞激活過程中具有纖維化抑制效力。
免疫染色顯示AAV9-Postn-Pknox2-GFP在成年小鼠心臟中的過表達(dá)效率和感染特異性
02 結(jié)果展示
1. 健康心臟成纖維細(xì)胞群與轉(zhuǎn)錄調(diào)控
作者建立了一個組織加工管道，用于核分離和snRNA-seq，并發(fā)現(xiàn)這種優(yōu)化的snRNA-seq技術(shù)應(yīng)用于成人心臟的基因檢測結(jié)果優(yōu)于scRNA-seq技術(shù)，具有良好的穩(wěn)健性和可重復(fù)性。通過這種無偏倚的方案，作者表征了健康人類心臟的細(xì)胞組成，并研究了參與決定主要心臟細(xì)胞亞型的細(xì)胞身份和功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。在表征健康心臟成纖維細(xì)胞群與轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，作者發(fā)現(xiàn)一種新的調(diào)節(jié)因子PKNOX2與健康心臟中成纖維細(xì)胞的生理激活有關(guān)。
圖1 健康心臟成纖維細(xì)胞群與轉(zhuǎn)錄調(diào)控
2. PKNOX2在衰竭心臟纖維化過程中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)
作者接下來驗證這些轉(zhuǎn)錄因子在維持體內(nèi)平衡中的作用，對移植衰竭心臟進(jìn)行了snRNA-seq分析。發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，移植衰竭心臟的成纖維細(xì)胞中鑒定出8個具有不同基因特征和豐富功能的成纖維細(xì)胞亞簇。偽時間分析觀察到從間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞樣纖維母細(xì)胞（FB）到病變FB存在兩條主要軌跡，表明心力衰竭中存在復(fù)雜的多向重構(gòu)。軌跡1顯示纖維化評分從基底成纖維細(xì)胞到myoFB呈梯度增加，這可能反映了心肌纖維化形成過程起源于常駐成纖維細(xì)胞，此外POSTN和MEOX1的表達(dá)在成纖維細(xì)胞激活起始時間開始增加，而PKNOX2的表達(dá)在此時達(dá)到峰值，并從活化的FB到myoFB逐漸下降，這些結(jié)果提示PKNOX2可能具有負(fù)調(diào)控作用，特別是在從生理激活到病理性纖維化的過渡階段。為了驗證PKNOX2在心肌重構(gòu)過程中的表達(dá)模式，作者檢測了供體心臟左心室心肌、DCM心臟左心室心肌(DCM LV)和DCM心臟右心室心肌(DCM RV)的蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)PKNOX2在DCM RV成纖維細(xì)胞中顯著增加，并與POSTN共定位，但這種增加在嚴(yán)重纖維化的DCM LV成纖維細(xì)胞中消失。
圖2 PKNOX2在衰竭人心臟成纖維細(xì)胞重塑過程中的表達(dá)
3. 體外過表達(dá)PKNOX2抑制成年小鼠心臟成纖維細(xì)胞活化
為了驗證PKNOX2在成纖維細(xì)胞活化和纖維化形成中的功能，作者在體外和體內(nèi)進(jìn)行了功能喪失和功能獲得的研究。使用siRNA在永生化成年小鼠心臟成纖維細(xì)胞(AMCF)中敲低PKNOX2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SMAD2的表達(dá)和磷酸化水平均上調(diào)，同時纖維化標(biāo)志物a-SMA的表達(dá)增加，提示纖維化TGF-β-SMAD2通路的激活導(dǎo)致PKNOX2功能不足。此外Pknox2的敲低可以誘導(dǎo)纖維化激活達(dá)到與TGF-β刺激相同的水平。但在Pknox2敲低的基礎(chǔ)上，TGF-β刺激并沒有誘導(dǎo)纖維化的增量激活。作者還通過Adv-PKNOX2 (維真提供)在AMCFs中過表達(dá)PKNOX2，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，纖維化激活標(biāo)志物(Postn, Col3a1, Ltbp2)在PKNOX2過表達(dá)的細(xì)胞中被顯著抑制。通路富集分析顯示，下調(diào)基因參與細(xì)胞外基質(zhì)組織、間充質(zhì)細(xì)胞分化和膠原原纖維組織，而上調(diào)基因與細(xì)胞增殖相關(guān)。此外PKNOX2過表達(dá)抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維化基因表達(dá)和SMAD2通路激活。
圖3 體外過表達(dá)PKNOX2抑制成年小鼠心臟成纖維細(xì)胞活化
4. PKNOX2過表達(dá)抑制TAC誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化
為了證實PKNOX2在病理性心肌纖維化中的作用，作者構(gòu)建了成纖維細(xì)胞特異性PKNOX2敲除小鼠，并通過主動脈橫縮(TAC)手術(shù)誘導(dǎo)心力衰竭模型。發(fā)現(xiàn)TAC術(shù)后4周，Pknox2 CKO小鼠的心重/體重比明顯高于對照組。體內(nèi)超聲心動圖評價證實，與對照組相比，Pknox2-CKO小鼠心肌功能下降，左心室增大。Masson染色顯示，Pknox2-CKO小鼠TAC誘導(dǎo)的心臟纖維化也明顯加重。Pknox2-KO小鼠中與纖維化和心力衰竭相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)。以上表明，PKNOX2的功能喪失加重了壓力過載引起的心臟纖維化和功能障礙。隨后作者利用AAV9-Postn-Pknox2-GFP（維真提供）在體內(nèi)過表達(dá)PKNOX2，發(fā)現(xiàn)PKNOX2過表達(dá)小鼠的心臟重量/體重比明顯低于對照組，心肌功能得到有效改善，并且減輕了TAC誘導(dǎo)的纖維化，纖維化和心力衰竭相關(guān)基因的表達(dá)也明顯下調(diào)。總體而言，這些結(jié)果表明Pknox2過表達(dá)減輕了壓力過載誘導(dǎo)的心臟纖維化。
圖4 PKNOX2過表達(dá)抑制TAC誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化
03 實驗結(jié)論
本研究為心肌單核RNA測序分析建立了一條高質(zhì)量的管道。通過這一優(yōu)化方案，能高效描述主要心臟細(xì)胞亞型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并確定了PKNOX2是抑制纖維化的新型調(diào)節(jié)劑，也是未來轉(zhuǎn)化研究的潛在治療靶點(diǎn)。