01研究背景
脊髓損傷(SCI)是一種常見且嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可導致?lián)p傷平面以下神經(jīng)功能障礙，誘導多能干細胞（iPSCs)可以個性化分化為神經(jīng)干細胞(NSCs)，從而有效地為SCI提供移植細胞來源。近期，中南大學湘雅醫(yī)院、中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所聯(lián)合北京藥理學與毒理學研究所在Cell Death & Bioactive Materials (IF 18.9) 上發(fā)表文章“Construction of functional neural network tissue combining CBD-NT3-modified linear-ordered collagen scaffold and TrkC-modified iPSC-derived neural stem cells for spinal cord injury repair”，基于TrkC修飾的iPSC衍生的NSCs和CBD-NT3修飾的線性有序膠原支架(LOCS)設(shè)計了功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織，并證實移植該組織可再生神經(jīng)元和突觸，改善損傷區(qū)域的微環(huán)境，增強細胞外基質(zhì)的重塑，促進脊髓損傷模型大鼠后肢功能恢復。
02 結(jié)果展示
1. 基于LOCS和iPSCs構(gòu)建功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織
為了進一步探討CBD-NT3和TrkC對體外功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織構(gòu)建的影響，作者設(shè)計了未經(jīng)CBD-NT3修飾的LOCS和未過表達TrkC的iPSC-NSCs作為對照組。使用Lv-TrkC（維真生物提供）轉(zhuǎn)染iPSCs，然后誘導其分化為NSCs，將CBD-NT3與LOCS孵育后，發(fā)現(xiàn)CBD-NT3能均勻地結(jié)合在LOCS上。為了確定CBD-NT3是否能與細胞膜上的TrkC結(jié)合，作者將CBD-NT3與細胞孵育，觀察到NT3和TrkC的共定位，Western Blot發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)CDB-NT3處理的iPSC-NSCs-TrkC細胞相比，CDB-NT3處理導致細胞中TrkC的磷酸化水平顯著升高，表明CBD-NT3可以結(jié)合細胞表面表達的TrkC并激活NT3/TrkC。作者在CBD-NT3修飾的LOCS上接種iPS-NSCs- TrkC構(gòu)建功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織，發(fā)現(xiàn)CBD-NT3修飾的LOCS可促進iPS-NSCs-TrkC的存活和增殖。
圖1 基于LOCS和iPSCs的功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織構(gòu)建
2. CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs構(gòu)建了功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)
作者發(fā)現(xiàn)LOCS+NT3+NSC-TrkC組表達膽堿能神經(jīng)元標志物ChAT、谷氨酸能神經(jīng)元標志物VGLUT1和成熟神經(jīng)元標記MAP2的水平高于對照組，表明iPSC-NSCs-TrkC細胞在CBD-NT3修飾的LOCS中有分化為興奮性神經(jīng)元的潛力。此外，在LOCS+NT3+NSC-TrkC組中檢測出更多的突觸素標記物SYN和突觸后密度標記物PSD95，表明LOCS+NT3+NSC-TrkC組在體外3D培養(yǎng)過程中具有更高的突觸形成潛力。作者還在LOCS+NT3+NSC-TrkC組中觀察到細胞已經(jīng)分化，細胞表面出現(xiàn)軸突樣突起，細胞通過這些過程相互接觸，形成類似神經(jīng)連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs可以用來構(gòu)建功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織。
圖2 CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs構(gòu)建了功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)
3. 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植促進脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元再生
作者構(gòu)建全橫斷面SCI模型，研究功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)移植對SCI的影響，發(fā)現(xiàn)功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植可以顯著改善脊髓損傷區(qū)微環(huán)境，促進細胞外基質(zhì)重塑。作者還測定了脊髓損傷區(qū)下行神經(jīng)元的恢復情況，發(fā)現(xiàn)LOCS+NT3+NSC-TrkC組的5-HT陽性神經(jīng)纖維遍及脊髓損傷區(qū)域，明顯優(yōu)于其他對照組，說明功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織植入脊髓損傷區(qū)可以建立損傷區(qū)與宿主脊髓之間的神經(jīng)聯(lián)系，重塑下行神經(jīng)元功能。ChAT和VGLUT1在LOCS+NT3+NSC-TrkC組的表達也更高，說明功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織在促進興奮性神經(jīng)元再生方面更有優(yōu)勢。此外，LOCS+NT3+NSC-TrkC組在脊髓損傷區(qū)中央發(fā)現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的神經(jīng)元，并在LOCS周圍生長和延伸，表明移植組織與受傷部位建立了神經(jīng)連接，并作為神經(jīng)回路的中繼站。
圖3 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植促進脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元再生
4. 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植可改善脊髓損傷大鼠運動功能
作者在移植手術(shù)后評價了大鼠的后肢運動功能，發(fā)現(xiàn)LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠BBB評分優(yōu)于其他組；斜網(wǎng)格攀爬結(jié)果證實，LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠后肢表現(xiàn)出明顯的自主運動，運動功能和協(xié)調(diào)能力均有明顯恢復。動物步態(tài)分析結(jié)果表明LOCS+NT3+NSC-TrkC組的大鼠恢復情況符合動物步態(tài)分析要求，停留強度曲線證實LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠的兩條后肢都能負重并在行走時移動。這些結(jié)果證實了LOCS支架移植可促進脊髓損傷大鼠后肢功能的恢復，基于CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織可以進一步顯著改善運動功能。
圖4 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植可改善脊髓損傷大鼠運動功能
03實驗結(jié)論
本研究首次嘗試利用iPSc-NSCs作為種子細胞，基于受體和配體的相互作用構(gòu)建功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織，有效地為外源NSCs的個性化獲取提供了解決方案，拓展了iPSC-NSCs和LOCS在脊髓損傷修復研究中的應(yīng)用前景，為脊髓損傷再生修復提供了一種新的生物材料設(shè)計思路。