01研究背景
腺苷（Adenosine，Ado）是一種連接細胞內代謝和細胞間通訊的核苷，在調節睡眠和癲癇等過程中起著重要作用。雖然細胞外Ado（eAdo）的功能已被充分證明，但由于缺乏體內檢測Ado的方法，目前對細胞內Ado（iAdo）的分布和調節功能的了解受到限制。2025年5月7日，北京大學藥學院王晶教授聯合中國科學院遺傳與發育生物學研究所武照伐研究員及北京大學生命科學學院李毓龍教授團隊在“Nature Communications (IF 14.7)”上發表文章“A high-performance fluorescent sensor spatiotemporally reveals cell-type specific regulation of intracellular adenosine in vivo”，該研究成功開發了首個用于檢測胞內腺苷的基因編碼熒光探針HypnoS，并借助多種活體成像前沿手段，深入探究了活體動物中胞內腺苷在時空動態上的細胞特異性調控，解析了腺苷穩態的復雜分子調控過程。
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基因信息
HypnoS：腺苷熒光探針
實驗動物
6-8周齡的野生型雌性C57BL/6N小鼠
病毒產品
AAV2/9-hSyn-HypnoS
AAV2/9-hSyn-HypnoS-mut
AAV5-GfaABC1D-HypnoS
AAV5-GfaABC1D-HypnoS-mut
注射方式
腦定位注射
注射量
300 nL
注射部位
腦運動皮層
AAV2/9-hSyn-HypnoS介導海馬中HypnoS表達
02 結果展示
1. HypnoS檢測iAdo動力學
作者基于循環重排綠色熒光蛋白（cpEGFP）與腺苷脫氨酶（PvADA）成功開發了檢測胞內腺苷的熒光探針HypnoS和對照探針HypnoS-mut，并在哺乳動物細胞中證明HypnoS是iAdo敏感、特異的傳感器。為了評估HypnoS檢測腦組織中iAdo動力學的靈敏度，作者使用AAV2/9-hSyn-HypnoS（維真生物提供）在小鼠體內表達HypnoS，發現HypnoS具有單細胞分辨率，在急性腦切片神經元中觀察到iAdo水平在2-DG誘導的代謝抑制和電刺激而逐漸升高。相反星形膠質細胞對電刺激的反應中iAdo水平的變化較小，但對100 μM Ado的應用有反應。這些結果表明，與星形膠質細胞相比，神經元中發生了不同的iAdo代謝過程，并突出了HypnoS在腦組織細胞類型特異性iAdo測量中的實用性。鑒于神經元活動和能量代謝在包括果蠅在內的各種物種中密切相關，作者在果蠅體內研究了這種關系，發現HypnoS特異性地響應于Ado，證實了HypnoS報告果蠅中內源性Ado變化的能力。這些發現證明無論在小鼠海馬切片還是在果蠅中，HypnoS在監測神經元活性誘導的iAdo增加方面具有高特異性和靈敏度。
圖1 HypnoS檢測小鼠腦切片iAdo動力學
2. 癲癇發作時iAdo的時空動態變化
先前的研究表明，iAdo在包括海馬和皮質在內的各種腦區中對癲癇發作起保護作用。作者通過新型HypnoS熒光探針與大視場活體成像技術，率先實現了活體小鼠全腦皮層范圍內腺苷在KA誘導的癲癇發作過程中的動態監測。此外作者通過在神經元特異性或星形膠質細胞特異性條件下表達HypnoS，研究了神經元和星形膠質細胞之間iAdo動力學的差異。發現神經元和星形膠質細胞HypnoS在KA注射后均顯示出顯著的熒光增加，與星形膠質細胞相比，神經元中的Ado升高表現出更長的衰減時間。這意味著體內神經元和星形膠質細胞中不同的iAdo代謝途徑。這些結果證明了HypnoS在癲癇發作活動期間以高靈敏度、分子和細胞類型特異性報告小鼠體內iAdo動力學的能力。
圖2 體內雙光子成像解析細胞類型特異性iAdo動力學
3. ENT 1/2調節睡眠-覺醒周期期間的iAdo水平
平衡轉運蛋白（ENT1/2）在調節iAdo水平及其與eAdo的偶聯中至關重要，不同睡眠-覺醒狀態期間的神經元iAdo動力學在很大程度上反映了分離的傳感器GRABAdo記錄的與神經元活動相關的eAdo動態，表明iAdo和eAdo之間的緊密偶聯。在糖酵解抑制和神經元激活條件下，與WT神經元相比，ENT 1/2敲除神經元中的iAdo水平顯著增加。相反，在以前的ENT 1/2 KO神經元研究中，作者使用ENT1/2抑制劑S-250后，沒有檢測到eAdo的增加。作者進一步比較了睡眠-覺醒周期期間由HypnoS記錄的iAdo動力學與野生型小鼠BF中的iAdo動力學，觀察到ENT 1/2 dKO在覺醒和REM睡眠期間顯著增加神經元中的iAdo，而在星形膠質細胞中，在覺醒和REM睡眠期間iAdo顯著降低。這些結果證明了HypnoS能在小鼠中檢測細胞類型特異性的ENT 1/2依賴性Ado轉運的能力。
圖3 HypnoS揭示ENT 1/2介導睡眠覺醒周期中的腺苷酸轉運
03 結論
本研究開發了全新的胞內腺苷熒光探針HypnoS，在活體動物中探究了生理及病理過程中胞內腺苷的細胞特異性時空動態，并在神經元及星形膠質細胞中可視化的檢測了ENT1/2介導的腺苷跨膜轉運，為理解腺苷的作用機制提供了全新工具。
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