口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是頭頸部常見的癌癥類型，每年有近70萬新發(fā)病例和38萬死亡病例。目前，基于病理診斷和腫瘤分期，OSCC主要采用手術(shù)、化療、放療聯(lián)合治療，其有效臨床治療仍然是一個挑戰(zhàn)，尚需開發(fā)有效的新藥。在不同的腫瘤中，苯乙雙胍已被證明比二甲雙胍具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性，然而，苯乙雙胍對OSCC細(xì)胞的影響尚不清楚。2024年5月8日，山東大學(xué)吳訓(xùn)偉/郭涇團(tuán)隊在“International Journal of Oral Science，IF 14.9”上發(fā)表論文Phenformin activates ER stress to promote autophagic cell death via NIBAN1 and DDIT4 in oral squamous cell carcinoma independent of AMPK。研究發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍誘導(dǎo)其新靶點DDIT4，特別是NIBAN1，促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡，從而抑制OSCC細(xì)胞的生長。本研究進(jìn)一步支持了苯乙雙胍的抗癌作用，為其在OSCC臨床治療中的發(fā)展提供了堅實的基礎(chǔ)。
研究結(jié)果
1、在體內(nèi)外實驗中，苯乙雙胍通過抑制OSCC細(xì)胞增殖、增強(qiáng)OSCC細(xì)胞凋亡和自噬來抑制OSCC的生長
研究發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍在體內(nèi)外均能顯著抑制OSCC細(xì)胞的生長，通過研究苯乙雙胍對OSCC細(xì)胞增殖和死亡的影響，發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍治療可以減少體外OSCC細(xì)胞的增殖，明顯提高細(xì)胞凋亡率；Western blot分析凋亡細(xì)胞中激活的caspase通路，進(jìn)一步驗證了苯乙雙胍誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍處理OSCC細(xì)胞中p62、ATG7、Beclin-1、ATG12和Lamp-1 mRNA水平顯著升高。此外，OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)記的LC3，然后用苯乙雙胍處理，GFP細(xì)胞的點狀染色顯著增加，這些數(shù)據(jù)表明苯乙雙胍可以促進(jìn)OSCC自噬。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍通過誘導(dǎo)自噬體的形成來促進(jìn)OSCC細(xì)胞自噬。
已有研究表明自噬可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此作者研究了苯乙雙胍誘導(dǎo)的自噬是否可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。自噬基因Beclin-1的敲低不僅可以阻斷自噬的誘導(dǎo)，還可以降低苯乙雙胍誘導(dǎo)的凋亡標(biāo)志物的表達(dá)，提示苯乙雙胍通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡。敲低Beclin-1可以恢復(fù)苯乙雙胍誘導(dǎo)的OSCC生長抑制，提示苯乙雙胍誘導(dǎo)自噬可促進(jìn)體外OSCC細(xì)胞死亡。作者進(jìn)一步在體內(nèi)驗證了這一結(jié)果，數(shù)據(jù)表明苯乙雙胍不僅抑制OSCC細(xì)胞增殖，而且促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡和自噬，從而在體外和體內(nèi)抑制OSCC細(xì)胞的生長。
圖1.苯乙雙胍在體外促進(jìn)OSCC細(xì)胞的細(xì)胞自噬
2、苯乙雙胍通過調(diào)控DDIT4和NIBAN1的表達(dá)誘導(dǎo)自噬的形成
為進(jìn)一步了解苯乙雙胍調(diào)節(jié)哪些信號通路來抑制OSCC細(xì)胞生長，作者對苯乙雙胍處理的CAL 27 OSCC以及對照細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)自噬信號通路的激活是苯乙雙胍對OSCC細(xì)胞的主要影響，RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)了兩個重要基因DDIT4和NIBAN1，苯乙雙胍處理顯著誘導(dǎo)其表達(dá)。接下來，為確定苯乙雙胍是否通過高水平表達(dá)DDIT4和/或NIBAN1來促進(jìn)自噬，進(jìn)行DDIT4和/或NIBAN1敲低處理，發(fā)現(xiàn)敲低DDIT4顯著抑制了苯乙雙胍誘導(dǎo)的p62、Beclin - 1、ATG7和自噬標(biāo)志物的表達(dá)，NIBAN1敲低以及DDIT4和NIBAN1雙敲低后也獲得了類似的結(jié)果，表明苯雙胍通過調(diào)節(jié)DDIT4和NIBAN1的表達(dá)來促進(jìn)自噬。據(jù)報道，DDIT4可負(fù)向調(diào)控mTOR通路，而NIBAN1可與mTOR通路相互作用，調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬。作者發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍抑制了OSCC細(xì)胞的mTOR通路，進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍通過抑制mTOR信號通路誘導(dǎo)DDIT4和NIBAN1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬。機(jī)制上，苯乙雙胍通過正向調(diào)節(jié)ATF4而非ATF3來促進(jìn)DDIT4和NIBAN1的表達(dá)誘導(dǎo)自噬，并且這種調(diào)節(jié)不依賴于AMPK的激活。
圖2. 抑制DDIT4和NIBAN1表達(dá)可阻斷苯乙雙胍誘導(dǎo)的自噬
3、苯乙雙胍直接誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，控制ATF4-DDIT4和NIBAN1的表達(dá)
接下來，作者證實了AMPK的敲低并不會抑制苯乙雙胍處理誘導(dǎo)的ATF3或ATF4的表達(dá)。ATF4是一種應(yīng)激反應(yīng)基因，在體外，二甲雙胍已被證明通過增加BIP、DDIT3和caspase-12的表達(dá)來激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，作者假設(shè)苯乙雙胍通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激直接增加ATF4的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活PERK，而PERK的激活導(dǎo)致其下游靶點eIF2α的激活，從而增加了ATF4的翻譯。進(jìn)一步實驗表明苯乙雙胍誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)膜應(yīng)激直接激活翻譯機(jī)制，增加ATF4的表達(dá)，從而控制DDIT4和NIBAN1，促進(jìn)自噬形成，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，最終抑制OSCC細(xì)胞生長。
圖3.苯乙雙胍通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)ATF4、DDIT4和NIBAN1的表達(dá)
小結(jié)
綜上，本研究確定了苯乙雙胍的兩個新靶點：DDIT4以及NIBAN1，并發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍不依賴AMPK的激活，而是誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而激活PERK / eIF2α / ATF4軸通路，增強(qiáng)DDIT4和NIBAN1的表達(dá)，導(dǎo)致mTOR抑制，促進(jìn)自噬，從而抑制OSCC細(xì)胞的生長。研究結(jié)果進(jìn)一步支持了苯乙雙胍的抗癌功能，并為將來開發(fā)苯乙雙胍用于OSCC的臨床治療提供了堅實的基礎(chǔ)。