AAV在心臟研究中的靶向策略【應用篇】

通過上一期AAV在心臟研究中的靶向策略（干貨篇）對rAAV在心臟實驗中的啟動子、血清型以及注射方式的選擇策略的學習，相信大家對rAAV在心臟研究中的應用已有所了解，今天小V將和大家一起，通過幾個案例深入了解一下關于AAV在心臟研究中的具體應用。

維真客戶AAV心臟注射實例

維真客戶AAV心臟注射實例 01

Zinc finger and BTB domain-containing protein 20 aggravates angiotensin IIinduced cardiac remodeling via the EGFR-AKT pathway

ZBTB20（鋅指和BTB結構域蛋白20）是來自POK家族的轉錄因子，被證明在維持心臟收縮中發揮關鍵作用，但在心臟重構中的作用尚未被闡明。本研究中，作者用血管緊張素II（Ang II）誘導小鼠心臟重塑模型，探討ZBTB20在心臟重構中的作用。研究發現ZBTB20在Ang II誘導的心臟重塑和心肌細胞損傷反應中表達升高；AAV9（心肌注射）介導的ZBTB20過表達，可導致心壁肥厚、心室擴張、纖維化增加和射血分數降低，而敲低ZBTB20后可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響。從分子機制來看，ZBTB20通過EGFR-Akt信號通路加重Ang II誘導的心臟重塑反應，本研究闡明了ZBTB20在不良心臟重構向心力衰竭的轉變中的作用，并為誘導不良心臟重構的分子機制提供了依據。

病毒產品	AAV9-ZBTB20 & AAV9-shZBTB20
實驗動物	8-10周齡雄性C57BL/6小鼠
注射方式	心肌注射
注射量	10 μl/site，1*10E11vp，三點注射

如圖1所示，使用AAV9病毒載體在小鼠心臟中過表達ZBTB20， ZBTB20-NS組和ZBTB20-Ang II組ZBTB20蛋白表達水平均明顯升高，并且ZBTB20-Ang II組的ZBTB20蛋白表達水平高于ZBTB20-NS組。Ang II處理四周后，ZBTB20注射組較NC組心肺重量更高，同時小鼠左心室和心肌細胞肥大增加，這提示ZBTB20組出現心肌肥大和肺水腫。此外,多種不良心臟重構和纖維化分子標志物轉錄增加，血管周圍和間質纖維化變得更為嚴重，這些數據表明ZBTB20的過表達促進了不良的心臟重構發展為心力衰竭。

圖1. ZBTB20的過表達加重了心臟重構

如圖2所示，使用AAV9 RNA干擾ZBTB20，WB檢測到ZBTB20蛋白水平大大降低。小鼠心肌細胞經轉染ZBTB20 siRNA后肥大反應明顯降低，而且細胞表面積變小，心臟重構分子標志物Anp和β-Mhc的轉錄水平也有所降低，表明敲低ZBTB20可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響。

圖2.敲低ZBTB20可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響

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維真客戶AAV心臟注射實例 02

MiR-590-5p inhibits pathological hypertrophy mediated heart failure by targeting RTN4

由各種心臟疾病導致的心力衰竭（HF）是造成當今社會人群死亡的主要原因之一，目前尚無特別有效的治療方法，尋找新的標志物對HF的診斷和治療具有重要意義。前期研究發現miR-590-3p可顯著增加幼鼠及成年大鼠心肌細胞的增殖，并且在肺動脈高壓兒童患者上腔靜脈血液中表達上調。網狀內皮素4（RTN4）被證實在肥厚性心肌病動物模型中顯著上調，同時參與冠心病調控，可作為心衰的指標。此外，RTN4還是miR-590-5p的預測下游靶點。基于這些研究結果，研究人員探索了miR-590-3p和RTN4在HF中的關系。

研究人員采用主動脈弓縮窄術制備小鼠HF模型，并對小鼠心力衰竭的的病理進程進行分析觀察，發現miR-590-5p在HF小鼠心臟組織中表達下調,尾靜脈注射AAV9-miR-590-5p可減輕心肌肥厚和心肌細胞凋亡。此外，miR-590-5p過表達可促進H9C2細胞活力，抑制細胞凋亡，降低心肌重塑水平。機制上，miR-590-5p結合到RTN4 3 'UTR，通過負調控RTN4 調節心肌細胞表型。綜上所述，miR-590-5p通過下調RTN4調控HF心肌肥厚和心肌細胞凋亡。

病毒產品	AAV9-miR-590-5p & AAV9-NC
實驗動物	8-10周齡雄性C57BL/6小鼠
注射方式	尾靜脈注射
病毒滴度	1*10E12vg/mL

如圖3所示，通過RT-qPCR驗證AAV9-miR-590-5p在小鼠中的表達大幅提高。miR-590-5p的過表達降低了小鼠LVEDD（左心室舒張末期內徑），減輕了小鼠心肌的水腫和肥厚。此外，miR-590-5p的過表達還顯著降低了小鼠心臟組織ANF、BNP和β-MHC(心臟重構標志物)的蛋白水平，同時使Bcl-2（細胞凋亡抑制基因）蛋白水平升高及Bax（細胞凋亡促進基因）蛋白水平降低。綜上所述，miR-590-5p過表達可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙。

圖3. MiR-590-5p過表達可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙

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維真客戶AAV心臟注射實例 03

The deubiquitinase UCHL1 regulates cardiac hypertrophy by stabilizing epidermal growth factor receptor

病理性心臟肥大可導致心力衰竭。研究證實在促心肌肥厚途徑中表皮生長因子受體（EGFR或ErbB1）是正調控因子，EGFR的穩定性、轉運和激活主要受翻譯后修飾的調控，然而其具體調控機制尚不完全清楚。研究表明去泛素化酶UCHL1在心肌梗死后的心肌細胞中表達高度上調，但是人們對其在調節心肌肥厚和重構中的作用知之甚少。

在本研究中，研究者通過功能缺失和功能獲得的方法并使用抑制劑，證實UCHL1在激動劑誘導的心肌肥厚細胞及衰竭心臟中表達上調，過表達UCHL1（AAV9，尾靜脈注射）可加速壓力超負荷誘導的心肌肥厚，而下調UCHL1則可顯著改善由激動劑或壓力超負荷引起的心肌肥厚；同時闡明了UCHL1通過降低EGFR泛素化和降解正向調節心肌肥厚，全身給藥UCHL1抑制劑可顯著逆轉心肌肥厚和重構。綜上所述，這些發現表明UCHL1在心肌肥厚的發病機制中發揮重要作用，可作為肥厚治療的靶點。

病毒產品

rAAV9-CMV-UCHL1 & rAAV9-CMV-GFP

實驗動物

9周齡C57BL/6J小鼠

注射方式

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