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一、 AAV 載體概述

腺相關(guān)病毒(AAV)是一種無包膜的單鏈 DNA 病毒，是細(xì)小病毒家族的一員，通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的幫助，才能進(jìn)行自我復(fù)制。在沒有輔助病毒的情況下， AAV 可在哺乳動物細(xì)胞中長期潛伏。現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的 AAV 有 12 種的血清型（AAV1 至AAV12）和 130 多種突變型[1] 。不同 AAV 血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)、序列 和組織特異性，因而其識別與結(jié)合的細(xì)胞表面受體也相應(yīng)有很大差別[2]，這也導(dǎo)致不同 血清型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型和感染效率也各不相同。在基因治療中，將攜帶有外源基因的重組腺相關(guān)病毒定點(diǎn)整合到宿主基因組，既能克服隨機(jī)插入所導(dǎo)致的染色體缺失和基因重排等 潛在危險，又可以達(dá)到長期治療的目的。

野生型 AAV 基因組編碼兩大開放閱讀框架(open reading frames，ORF) rep 和 cap，它們位于兩側(cè)的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列(interted teminal repeats，ITRs)之間。維真生物的 AAV 病毒基因傳遞系統(tǒng)中，只有 ITRs 是復(fù)制和包裝所必需的順式元件，rep 和 cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒 AAV rep/cap Vector 中，轉(zhuǎn)移后空出的位置 是允許外源基因插入病毒基因組中的大限度。在輔助質(zhì)粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 的幫助下，僅需兩端的 ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒 顆粒。

重組腺相關(guān)病毒是基因傳遞和表達(dá)的一個重要工具[3]，其具有廣泛的宿主范圍及 組織感染能力，既能感染分裂細(xì)胞，也能轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因進(jìn)入非分裂細(xì)胞，長期表達(dá)外源基 因，而不依賴于宿主細(xì)胞活躍的分裂能力。在 維真生物的 AAV 病毒基因傳遞系統(tǒng) 中，包含末端重復(fù)序列(ITRs)的載體質(zhì)粒 pAV-FH AAV 載體與包含 rep/cap 基因的輔助質(zhì) 粒 pAAV-rep/cap 載體沒有任何共同區(qū)域，避免通過重組而恢復(fù)出野生型病毒，宿主細(xì)胞 免疫反應(yīng)被降至較低，從而允許對具有免疫能力的宿主細(xì)胞進(jìn)行基因傳遞。我們的 AAV 病 毒基因傳遞系統(tǒng)可以生產(chǎn)出重組病毒滴度≥10E11 病毒顆粒/毫升的病毒，濃縮后滴度可高達(dá) 10E14 病毒顆粒/毫升，可以較大程度保證在動物細(xì)胞中的基因傳遞。rAAV 進(jìn)入細(xì)胞 后，作為附加的 DNA 能穩(wěn)定存在。基因的表達(dá)通常在第 2?7 天出現(xiàn)峰值，并可在體內(nèi)持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月。

二、 腺相關(guān)病毒基因傳遞和表達(dá)的優(yōu)勢

1.宿主范圍廣：隨時可轉(zhuǎn)染的 AAV 可高效感染分裂和非分裂細(xì)胞；

2.多種血清型 ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和 AAV9 等

3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分別由獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá)；未發(fā)現(xiàn) AAV 對人體致 病，rAAV 去除了 wtAAV 基因組的 96%，進(jìn)一步保證了安全性；

4.免疫原性低：AAV2 的基因組僅 4681 個核苷酸，便于用常規(guī)的重組 DNA 技術(shù)進(jìn)行操 作，而且進(jìn)行動物實驗時造成的免疫反應(yīng)

小。

三、 維真腺相關(guān)病毒的優(yōu)勢

1）載體全：不同的啟動子（神經(jīng)特異性啟動子 Human Synapsin、CamkIIα、GFAP 等）和多種報告基因（EGFP、mCherry、RFP 和 luciferase 等）可供客戶選擇；

2) 貨期短：AAV 克隆載體均與我們 18,000 個預(yù)制人類全長 cDNA ORF 克隆載體 MCS 區(qū) 通用，行業(yè)中短的生產(chǎn)周期2-3即可發(fā)貨；

3）滴度高：可提供 1012V.G/ml 及以上滴度的病毒.，可高達(dá) 1014V.G/ml；

4）服務(wù)優(yōu)：可根據(jù)客戶的具體需求提供特殊定制服務(wù)。

四、維真 rAAV產(chǎn)品簡介

維真生物獨(dú)有的**技術(shù)和創(chuàng)新性的 rAAV 載體和完善的 AAV 表達(dá)系統(tǒng)，可用于體內(nèi)和體外表達(dá) shRNA，human ORF 和 CRISPR，具有穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、純度高、滴度高的優(yōu)點(diǎn)。

AAV無輔助病毒系統(tǒng)（AAV Helper-Free System）可以在無輔助病毒的條件下生產(chǎn)出 重組人腺相關(guān)病毒。這種系統(tǒng)利用已經(jīng)明確與調(diào)節(jié)AAV 復(fù)制和表達(dá)的腺病毒基因產(chǎn)物，并 且將這些基因產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)染引進(jìn)宿主細(xì)胞。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個質(zhì)粒（Cis質(zhì) 粒、輔助質(zhì)粒、Rep/Cap質(zhì)粒）組成。生產(chǎn)具感染性的AAV 病毒顆粒所需的腺病毒基因產(chǎn) 物（例如：E2A,E4 和VA RNA 基因）大部分由與其他質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的pHelper 質(zhì)粒提 供，其余的腺病毒基因產(chǎn)物由穩(wěn)定表達(dá)腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主細(xì)胞提供。Rep 和 Cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒載體中，實 際上在輔助質(zhì)粒的幫助下，僅需兩端的ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒顆 粒，Rep 和Cap 基因的轉(zhuǎn)移后空出的位置是允許外源基因插入病毒基因組中的較大限度。 Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與Rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有 復(fù)制的能力。維真生物的腺相關(guān)病毒載體ITR序列Rep/Cap基因分別由獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá),具 有高度安全性。

rAAV進(jìn)入細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)的過程

1.rAAV 載體

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維真生物為您提供了多種腺相關(guān)病毒載體。包裝 AAV 無需輔助腺病毒，非致病性、免疫原性低。AAV 包裝系統(tǒng)包括輔助質(zhì)粒和 Rep/Cap 質(zhì)粒，ITR 序列和 rep/cap 基 因分別位于獨(dú)立的質(zhì)粒，安全性高。多種血清型 (AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9)可供選擇。根據(jù)不同客戶的需要，提供了分別適用于 human ORF、shRNA 和 CRISPR 、TALEN 基因組靶向操作服務(wù)的 AAV 載體。

2.rAAV 克隆服務(wù)

2.1 rAAV Human ORF 克隆服務(wù)

維真為 human ORF 克隆設(shè)計的 pAV-FH AAV 載體，具有 Amp 抗性、CMV 啟動子，帶有 Flag-His 標(biāo)簽。多克隆位點(diǎn)與維真的 human ORF 穿梭克隆 相兼容。非常適于哺乳動物 ORF 的表達(dá)。

2.2 rAAV shRNA 克隆服務(wù)

維真為您提供了多種表達(dá) shRNA 的 rAAV，包括 U6 或 H1 啟動子和作為哺乳動物 表達(dá)標(biāo)記的 GFP 或 RFP。同時，也可根據(jù)您感興趣的基因提供 shRNA 設(shè)計服務(wù)。

2.3 rAAV載體容量

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腺相關(guān)病毒載體能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞。毒性和免疫原性低，適合以相對較高的 轉(zhuǎn)染效率在非分裂細(xì)胞中長期表達(dá)和在分裂細(xì)胞中短期表達(dá)基因。但AAV載體的外源基因 容納量有限，兩個ITR之間的空間只有4.7kb，因此可插入的外源基因為3.5kb甚至更小。 請參閱本表選擇適合您的病毒載體系統(tǒng)。

五、腺相關(guān)病毒顆粒生產(chǎn)流程

第一步：基因克隆。將外源基因克隆進(jìn)入維真生物公司的人源或 shRNA 腺相關(guān)病毒載 體，pAV-FH AAV 等載體的多克隆位點(diǎn)與我們的 human ORF 穿梭克隆相兼容，非常適于哺乳動物 ORF 的表達(dá)。

第二步：細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將攜帶外源基因的重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 共轉(zhuǎn)染進(jìn)入 HEK293T 細(xì)胞，感染 72h 之后即包裝完畢。

第三步：收毒。分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀，PEG8000 沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，培養(yǎng) 基上清先用 0.45um 濾膜過濾。

第四步：病毒純化。通過碘克沙醇法對病毒進(jìn)行純化，一方面提高病毒滴度，另一方面某些 動物實驗需要純化之后才可進(jìn)行。

第五步：滴度檢測。用 QPCR 的方法來檢測病毒的滴度，得到的結(jié)果為包裝得到的病毒顆粒數(shù)。

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維真生物的 pAV-FH AAV 載體，具有 Amp 抗性、CMV 啟動子，帶有 Flag-His 標(biāo)簽。多克隆 位點(diǎn)與?維真生物的 human ORF 穿梭克隆相兼容。非常適于哺乳動物 ORF 的表達(dá)。維真生物為您提供了多種表達(dá) shRNA 的 rAAV，包括 U6 或 H1 啟動子和作為哺乳動物表達(dá)標(biāo)記的 GFP 或 RFP。同時，也可根據(jù)您感興趣的基因提供 shRNA 設(shè)計服務(wù)。

pAAV-rep/cap 質(zhì)粒（圖）包含 AAV 編碼復(fù)制蛋白和病毒衣殼蛋白的 rep 和 cap 基因，獲得 期望的高滴度病毒產(chǎn)品的關(guān)鍵基因。

pHelper 質(zhì)粒（圖）包含 AAV-HEK293T 生產(chǎn)高滴度病毒必須的的腺病毒基因 VA，E2A 和 E4的集合。提供 AAV 生產(chǎn)所必需的腺病毒蛋白質(zhì) E1A 和 E1B 在 HEK293T 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

生產(chǎn)流程示意圖

1.腺相關(guān)病毒重組克隆構(gòu)建

1）根據(jù)訂單不同選擇不同的載體，在此以人源基因克隆為例。

2）維真生物的 AAV 載體與我們的人源 ORF 庫中的穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)相兼容，通過酶 切，連接，轉(zhuǎn)化的方式將基因亞克隆進(jìn)入 pAV-FH AAV 載體，得到陽性克隆之后進(jìn)行酶切跑膠驗 證及測序以確認(rèn)插曲片段的正確性。

2.細(xì)胞凍存流程

1)按照培養(yǎng)細(xì)胞流程，將細(xì)胞吹下來加入 50ml 離心管中， 800g 離心 5min。

2)配制凍存液，90% 血清，10% DMSO，混勻。

3)離心后去上清，將配制的凍存液加入，將細(xì)胞吹勻

4)取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記和日期。

5)放入裝有異丙醇的凍存盒中，放入-80 度冰箱過夜。（凍存盒要提前一天從冰箱中拿至室 溫，使異丙醇的溫度達(dá)到室溫，每次凍存前確保異丙醇的加入量在刻度線上）。

6)第二天將凍存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

3.細(xì)胞復(fù)蘇流程

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1)10cm 培養(yǎng)盤中加 10cm 新鮮 DMEM 培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱預(yù)熱至 37℃。

2)從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37 ℃ ～38℃水浴中，使其融化（1-2 分鐘左右）。

3)待細(xì)胞凍存管中溶液尚未完全融化時加入預(yù)熱的培養(yǎng)盤中。

4)搖晃均勻，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5)4h 后待細(xì)胞完全貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基（除去凍存液中 DMSO 對細(xì)胞的毒害作用。也可在第 3步中 800g 離心 5min，除去培養(yǎng)基后再懸浮細(xì)胞添加至新鮮預(yù)熱的 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)皿中）。

4.細(xì)胞培養(yǎng)流程（以 10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，傳代為例）

1)生物安全柜紫外滅菌半小時。

2)滅菌期間，DMEM 培養(yǎng)基(含 10%FBS，1%青鏈霉素混合液)、PBS 以及 0.25%胰酶在 37℃水浴鍋中預(yù)熱。

3)取匯合度接近 100%活性好的的 HEK293T 細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)盤中培養(yǎng)基，加約 5ml，1×PBS，搖晃幾下，吸棄 PBS。（加 PBS 目的主要除去殘留在皿中的培養(yǎng)基中的 FBS，以提 高胰酶的消化效率）

4)加 1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜內(nèi)消化約 1min，室溫低時可放置于培養(yǎng)箱中消化。消 化時間不宜過長，否則影響細(xì)胞再次貼壁效率和活性。

5)加入約 5ml 的預(yù)熱的培養(yǎng)基。

6)用移液管吹打均勻，按照 1:3 比例傳代。各洗 2ml 培養(yǎng)基至新的 10cm 皿中，再加入8ml 預(yù)熱的 DMEM 培養(yǎng)基。（吹打過程中不可用力過大，否則會吹破細(xì)胞）。

注意：傳代盤數(shù)較多時，要先將預(yù)熱的 DMEM 培養(yǎng)基加入到 10cm 皿中，再加入含細(xì)胞的培 養(yǎng)基，以避免細(xì)胞分布不均。放置于培養(yǎng)箱前輕輕混勻皿中的培養(yǎng)基，使細(xì)胞均勻分散于 培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)條件為 5%-7%CO2 濃度，37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)無菌水盤內(nèi)水份提供一定的 濕度。細(xì)胞傳盤以及分 6 孔板，24 孔板，96 孔板分細(xì)胞都經(jīng)過上述流程，只是細(xì)胞數(shù)與分的比 例不同，具體情況具體操作。

5.AAV 病毒包裝

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以 10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿為例

第一天: 聚合度 90%以上的 HEK293T 細(xì)胞按 1：3 比例傳盤（每盤大約 2.5 x 106），培 養(yǎng)基 Hyclone 高糖 DMEM 培養(yǎng)基（含 10%FBS）。

第二天: 轉(zhuǎn)質(zhì)粒前 1-2h 左右，換成無血清培養(yǎng)基（所有血清型 AAV），用轉(zhuǎn)染試劑將目 的基因質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（需用酚氯仿提取的質(zhì)粒）轉(zhuǎn)入 HEK293T 中。

第三天：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 24h 后，換新的無血清培養(yǎng)基（所有血清型 AAV）

第五天：轉(zhuǎn)染 72h 收毒。帶著培養(yǎng)基，吹下細(xì)胞，離心；然后分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞 沉淀。用 PEG8000 沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，沉淀過夜后收集病毒沉淀。

6.AAV 病毒純化

1)收集病毒沉淀和細(xì)胞沉淀。

2)細(xì)胞沉淀-80℃保存，后續(xù)實驗用。

3)破碎細(xì)胞。

4) 將病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度離心進(jìn)行純化。

7.病毒濃縮

用超濾管進(jìn)行濃縮。

8.病毒滴度檢驗

1)腺性相關(guān)病毒處理破除 AAV 病毒外殼 ，37 ℃ 孵育 30 min，然后加熱 95 ℃5 min 使 酶失活，體系如下：

組成成分 體積

病毒液 5ul

蛋白酶 K（5ug/ul） 1ul

超純水 4ul

2)離心 12000rpm,2min.取上清。

3)標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，7 個梯度稀釋濃度分別：

7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V. G./UL,7.2E+2V.G./UL.并將超純水作為陰性對照。

4)配制 PCR 反應(yīng)體系，每個樣品 20 ul 體系，體系如下：

組成成分 體積

2X SYBRGreen 緩沖液 10ul

F、R 引物混合物 0.8ul

超純水 7.2ul

病毒樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 2ul

5)PCR 反應(yīng)體系

95℃ 5min；

95℃ 15sec

60℃ 15sec

72℃ 15sec

40 個 cycles

6)病毒顆粒數(shù)公式：病毒顆粒數(shù)（個/ml）= 與標(biāo)準(zhǔn)品相對值 × 1000

六、 腺相關(guān)病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實驗

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以 2 型 AAV 病毒為例，維真生物為您推薦的 MOI 值 10000:1-100000:1，是根HEK293T 細(xì)胞得出的數(shù)據(jù)，不同的細(xì)胞所使用的病毒 MOI 值會有所不同。建議您感染目的細(xì)胞前，進(jìn)行預(yù)實驗摸索最佳 MOI 值，推薦使用有熒光的對照病毒來摸索條件。

1. 為了節(jié)省病毒，推薦使用 96 孔板進(jìn)行預(yù)實驗。

2. 將目的細(xì)胞接種于 96 孔板中，細(xì)胞融合率為 50%較佳。為保證細(xì)胞生長良好，請保 證細(xì)胞貼壁過夜。

3. 取 10ul AAV 病毒原液加入 90 ul 培養(yǎng)基中做 1:100 稀釋（10-2），以此為起點(diǎn)做梯度 稀釋直至稀釋 10-7。可根據(jù)實際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

4. 取出提前準(zhǔn)備好的 96 孔板，先確定細(xì)胞生長狀況是否良好。用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替 代舊培養(yǎng)基，注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對照組。

5. 在加入病毒稀釋液后，請在 12-24h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)來確認(rèn)加入的病毒量是否合適，是 否因為加入的病毒量影響細(xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞沒有變化，即所加病毒對細(xì)胞沒有毒性，可 以繼續(xù)培養(yǎng)。

6. AAV 病毒對細(xì)胞的感染較慢，請在感染細(xì)胞后每天觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況。 (成功 案例: 山大醫(yī)院學(xué)生利用我司提供的 AAV 病毒感染 jurkat，ca46 細(xì)胞,在 MOI 值 105 時,一個星期后看到熒光表達(dá),并且成功通過 WB 檢測到目的基因的表達(dá))（如果您選擇的產(chǎn)

品帶有 GFP 標(biāo)簽，如果沒有熒光標(biāo)簽請選擇在 96 小時以后的不同時間段分別收獲細(xì)胞 并通過 Western-Blot 或其他檢測手段來檢測基因表達(dá)）。

注：由于 AAV 組織特異性，體外感染細(xì)胞的效率比較低，所以我們強(qiáng)烈推薦您購買 AAV用于動物實驗。

七、 AAV 使用情況實例分析

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1.AAV 感染不同種類的細(xì)胞

AAV 雖然也可體外感染一些細(xì)胞，但感染效率比較低。具體感染效率可以參考本手冊的常見問題 解答中的附表。

2.AAV 感染神經(jīng)干細(xì)胞

GFP NESTIN MERGE

Sorted cells were expanded for an additional26 days (total 40 days after AAV infection), and ~94.5% of cells maintained GFP and nestin expression

Jang J H, Koerber J T, Kim J S, et al. An evolved adeno-associated viral variant enhances gene delivery and gene targeting in neural stem cells[J]. Molecular Therapy, 2011, 19(4):

667-675.

由于 AAV 的低免疫原性，即便感染干細(xì)胞，也不會引起細(xì)胞的分化。

3. 各種類型的重組 AAV 注射入不同神經(jīng)發(fā)育階段的小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生不同分布

Chakrabarty P, Rosario A, Cruz P, et al. Capsid serotype and timingof injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain[J]. PloS one, 2013, 8(6): e67680. 注射方法：腦室注射10注射劑量：2×10v.p

4.不同血清型的 AAV 感染心臟心肌細(xì)胞

由于組織特異性，即便提高病毒的注射量，對于低表達(dá)的血清型，其所攜帶基因的表達(dá)水 平?jīng)]有太大的改善。由圖可知，AAV9 型對心肌細(xì)胞的感染效率極高，AAV8 次之。

5. 重組 AAV1-SERCA2a 轉(zhuǎn)導(dǎo)入豬冠狀動脈的表達(dá)

Hadri L, Bobe R, Molecular Therapy, 2010, 18(7): 1284-1292.

注射方法：冠狀動脈注射，注射劑量：10¹²v.p

6. AAV1 特異性感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及不同類型 AAV 感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的效果

Edmund R Hollis II， Ken Kadoya， Matthew Hirsch， Richard J Samulskiand Mark H Tuszynski

，Molecular Therapy , vol16 ,no. 2, feb, 2008.

注射方法：神經(jīng)肌肉注射 注射劑量：2.1x10E8 v.p

分別用 AAV1-6 感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，AAV1 的效果較好，感染運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目較多。

7.不同血清型 AAV 體外注射大鼠 5 天后在腦的海馬回中的表達(dá)

Ronald L. Klein, Robert D. Dayton, Nancy J. Leidenheimer, Karen Jansen, Todd E. Golde, and Richard M. Zweig. MOLECULAR THERAPY, 2006, 3 , 13(3).

8.AAV2 在研究小鼠脈絡(luò)膜新生血管形成中作為基因?qū)氲妮d體

Therapeutic effect of CBAPEDF-AAV2 on choroidal neovascularization development and antibody responses to AAV2 capsid following single and sequential intravitreal injections.

A-D:Representative CNV images from mouse eyes that were untreated (A), received a single intravitreal (IV) treatment (B), received first IV treatment (C), and received a second

IV treatment (D) of AAV2-PEDF.

Qiuhong Li, Rehae Miller, Ping-Yang Han, Jijing Pang, Astra Dinculescu, Vince Chiodo, William W. Hauswirth. Molecular Vision, 2008, 14:1760-1769. 注射方法：玻璃體腔內(nèi)注射

注射劑量：4x10E10 V.G.

9.AAV7,8 感染視錐形細(xì)胞

注射方法：在接近晶狀體的虹膜上切開一個小口后，緩慢（20-30 秒內(nèi)）注射。至少在 3個星期后進(jìn)行后續(xù)的實驗。 注射劑量：2ul。

10. scAAV9 介導(dǎo)的 CB-GFP 標(biāo)記靜脈注射入大鼠 3 周后在腦的星形膠質(zhì)和神經(jīng)元中表

a:紋狀體; b:海馬回；c:齒狀回；d :小腦浦肯野細(xì)胞; e:海馬回的椎體細(xì)胞 f:齒狀回的顆粒細(xì)胞；

a-d 新生鼠 e-f 成年鼠（f）200 mm (e); 100 mm (f),50 mm (a–d)

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射，注射劑量：4 × 10¹¹v.p

11.AAV8 感染肝臟肝細(xì)胞

注射方法：尾部靜脈注，注射體積：200ul、10¹²v.p

12. AAV9 介導(dǎo)的標(biāo)記注射成年小鼠 7 周后在脊髓和大腦的表達(dá)

a-d:頸椎，e-h:腰椎，i-l:星形膠質(zhì)細(xì)胞，m-p:腦

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult

astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射，注射劑量：4 × 10¹²v.p

13. AdVLacZ, AAV2LacZ, 和 AAV8LacZ 介導(dǎo)的標(biāo)記在 C57Bl/6 鼠的胰腺中的表達(dá)

AdVLacZ AAV2LacZ AAV8LacZ

胰腺胰島細(xì)胞

Wang A Y, et al. Comparison of adenoviral and adeno-associated viral vectors for pancreatic gene delivery in vivo[J]. Human gene therapy, 2004, 15(4): 405-413. 注射方式：胰腺注射，注射劑量： AdVLacZ-10 pfu；AAV2，8LacZ-10v.p

AAV 比腺病毒的持續(xù)表達(dá)時間要長很多，通常 AAV 可在體內(nèi)表達(dá)數(shù)周甚至數(shù)月，但是腺病 毒僅能表達(dá)幾天。

14. AAV-1-6，8 和慢病毒介導(dǎo)的 GFP 在大鼠的脊髓中的表達(dá)

Blits B, Derks S, Twisk J, et al.Journal of neuroscience methods, 2010, 185(2): 257-263.注射方法：脊髓注射,注射劑量：注射 5×10⁸v.p 不同外殼的 AAV 病毒

由圖顯示，AAV 介導(dǎo)的在大鼠脊髓中的基因表達(dá)要比慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)更高。AAV 比慢病 毒更容易轉(zhuǎn)染脊髓。

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六、常見問題解答

1.什么是 Adeno-associated virus (AAV) &重組 AAV(rAAV) & helper free rAAV?

腺相關(guān)病毒（AAV）屬于微小病毒科，是一類小的、二十面體、無包膜病毒。AAV 是一種 復(fù)制缺陷病毒，復(fù)制依賴于其他輔助病毒，如腺病毒和皰疹病毒。AAV 不編碼自己的聚合 酶，因此其復(fù)制過程依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶活性。

重組 AAV（rAAV）是人工改造的 AAV，沒有編碼 AAV 病毒復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白的 rep 和 cap 基 因。rAAV 中與復(fù)制和包裝相關(guān)的 rep 和 cap 基因被替換為 ITRs 間的基因或結(jié)構(gòu)，這使 rAAV 具有 4.1-4.7 kb 的包裝容量。

2.使用 AAV 有哪些生物安全性要求?

可在生物安全 1 級（BSL-1）實驗室操作生產(chǎn)無輔助病毒和編碼非致癌基因的重組 AAV。 另外，應(yīng)在生物安全 2 級（BSL