01研究背景
肝細胞癌(HCC)是全球第四大癌癥死亡原因，泛素-蛋白酶體系統、NF-κB通路、自噬等細胞信號通路都參與了HCC的發生發展。TRAF2作為銜接蛋白和泛素E3連接酶，在介導TNFα-NFκB信號通路中發揮重要作用，并在多種人類癌癥中表達失調，但TRAF2是否調節肝癌細胞的生長尚不清楚。
2023年， 浙江大學醫學院第一附屬醫院鄭敏、趙永超團隊在“Cell Death and Differentiation （IF 12.067）”上發表文章“The TRAF2-p62 axis promotes proliferation and survival of liver cancer by activating mTORC1 pathway”，發現TRAF2通過促進p62多泛素化來增強其與Raptor-RagC的結合，導致mTORC1激活，進而促進肝癌的發展，表明TRAF2是肝癌治療的潛在靶點。
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維真生物提供文中所用慢病毒載體：pLent-shRNA-p62
02部分結果展示
1. TRAF2負調控p62蛋白水平和自噬通量
作者發現HCC細胞系和HCC臨床組織中TRAF2 mRNA水平高于正常肝臟細胞和鄰近非腫瘤組織，同時還與HCC患者預后不良高度相關。為了探索TRAF2促進肝癌進展的機制，作者通過串聯親和純化和質譜分析，發現p62是TRAF2結合的候選蛋白。結構域分析發現，TRAF2的TRAF結構域和p62的TB結構域介導了TRAF2-p62的結合。為了探討TRAF2對p62的影響，作者研究了TRAF2是否影響HCC細胞系中p62蛋白的表達，發現敲低TRAF2顯著增加了HepG2和Huh7細胞中的p62蛋白水平，TRAF2過表達以劑量依賴的方式降低內源性p62水平。p62參與自噬調控，作者進一步研究了TRAF2對自噬的影響，發現TRAF2敲低會破壞HCC細胞的自噬通量。
圖1. TRAF2負調控p62蛋白水平和自噬
2. TRAF2促進p62的k63連接的多泛素化和溶酶體依賴性降解
由于TRAF2與p62相互作用并負向調節p62蛋白水平，作者假設TRAF2介導p62的降解。為了驗證這一假設，作者先研究了TRAF2對p62蛋白半衰期的影響，發現TRAF2敲低后p62的半衰期延長。之后作者研究了p62是否受到TRAF2誘導的多泛素化，發現TRAF2顯著促進p62多泛素化，進一步研究發現TRAF2促進p62在420賴氨酸殘基上的k63連接的多泛素化，且p62的降解是通過溶酶體介導的，而不是蛋白酶體系統。
圖2. TRAF2促進p62的k63連鎖多泛素化和溶酶體依賴性降解
3. TRAF2在體外和體內以p62依賴的方式促進腫瘤生長
由于p62是TRAF2的底物，作者接下來研究了p62在TRAF2敲除肝癌細胞中的作用機制，發現在TRAF2缺失的細胞中，p62的敲低促進了肝癌細胞的生長和存活，表明p62起抑制生長的作用。之后作者用小鼠異種移植腫瘤模型驗證了這一結果，將表達p62 shRNA的慢病毒轉染到TRAF2缺失的Huh7細胞中，擴增后接種裸鼠，發現p62敲低顯著逆轉TRAF2敲低對腫瘤生長的抑制作用，腫瘤體積和重量增加。進一步研究發現，p62敲低通過激活mTORC1活性，在體外和體內挽救了TRAF2敲低對腫瘤生長抑制。
圖3. TRAF2在體外和體內以p62依賴的方式促進腫瘤生長
4. TRAF2泛素化p62促進mTOR激活
由于p62敲低挽救了TRAF2敲除對生長的抑制，作者假設泛素化的p62可能是調控HCC生長的主要作用形式。為了驗證這一假設，作者將p62與其泛素死亡突變體重新轉染到p62缺失的Huh7細胞中，發現p62能顯著促進細胞和裸鼠異種移植模型的生長，并重新激活了腫瘤組織中的mTORC1活性，但p62泛素死亡突變體無上述功能。之后作者研究了p62泛素化調控mTORC1活性的機制，發現與p62相比，突變體抑制Raptor和RagC的結合，并導致mTOR與LAMP2的共定位減少，表明mTORC1的再激活減少。綜上所述，泛素化p62似乎是mTORC1激活的原因，mTORC1激活進一步促進了肝癌細胞的生長。
圖4. TRAF2泛素化p62促進mTOR激活
03實驗結論
本研究發現TRAF2促進肝癌細胞生長和存活。從機制上講，TRAF2通過促進p62多泛素化來增強其與Raptor-RagC的結合，從而導致mTORC1激活，進而促進了肝癌細胞的生長，表明TRAF2是肝癌治療的潛在靶點。