2023年7月20日，中國藥科大學(xué)李萍/陳君研究團(tuán)隊(duì)在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF 14.5）發(fā)表題為“A high-throughput Gaussia luciferase reporter assay for screening potential gasdermin E activators against pancreatic cancer”的文章。研究首次報(bào)道了用于高通量篩選潛在抗PDAC的GSDME激活劑的hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)，揭示該系統(tǒng)在鑒定引發(fā)GSDME依賴性焦亡的化合物和開發(fā)有前景的PDAC治療藥物方面具有重要意義。
01 研究背景
胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是胰腺癌的主要類型，占胰腺癌的95%，預(yù)后極差且當(dāng)前治療方法療效有限。研究發(fā)現(xiàn)，激活的蛋白酶caspase-3在gasdermin E（GSDME）缺乏的細(xì)胞中傾向于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在GSDME充足的細(xì)胞中傾向于誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。據(jù)報(bào)道GSDME在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中是沉默的，但其在PDAC細(xì)胞中高表達(dá)，因而由GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能是一種潛在的對抗PDAC的創(chuàng)新策略。
· 維真助力 ·
基因信息
gasdermin E（介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的GSDM蛋白家族成員）
實(shí)驗(yàn)動物
PANC-1 GSDME WT細(xì)胞異種移植的小鼠模型
病毒產(chǎn)品
AAV-shGSDME、AAV-shC
注射方式
瘤內(nèi)注射兩次，每次間隔三天
病毒用量
5.0x1011vg/mouse
02研究方法與結(jié)果
1. hGLuc-hGSDME-PCA篩選系統(tǒng)的構(gòu)建和條件優(yōu)化
正常情況下，GSDME蛋白在細(xì)胞質(zhì)中不具有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的活性。然而，當(dāng)特定刺激觸發(fā)caspase-3時(shí)，全長GSDME可以被caspase-3切割成GSDME-N和GSDME-C，隨后GSDME-N之間的相互作用促進(jìn)了焦亡的發(fā)生。利用簡單靈敏的GLuc報(bào)告基因，作者構(gòu)建了hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)，尋找能夠特異性激活GSDME并導(dǎo)致焦亡的化合物。將臨床治療胰腺癌的多種化合物或已發(fā)表的焦亡誘導(dǎo)劑施用于PANC-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)sorafenib表現(xiàn)出極好的焦亡誘導(dǎo)效果，并伴隨著細(xì)胞膜破裂和caspase-3裂解。隨后，作者在轉(zhuǎn)染試劑、DNA轉(zhuǎn)染量、DNA與轉(zhuǎn)染劑的比例、細(xì)胞接種密度等方面對hGLuc-hGSDME-PCA篩選系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。
hGLuc-hGSDME-PCA篩選系統(tǒng)的優(yōu)化
2. Ponatinib和perifosine抑制PDAC細(xì)胞的生長
作者利用hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)，對FDA批準(zhǔn)的抗癌藥物文庫進(jìn)行篩選，首次發(fā)現(xiàn)化合物ponatinib和perifosine可以誘導(dǎo)GSDME的裂解。進(jìn)一步的分析數(shù)據(jù)表明ponatinib和perifosine處理均可顯著抑制PDAC細(xì)胞系活力，抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和EdU插入實(shí)驗(yàn)證明ponatinib和perifosine抑制PANC-1細(xì)胞增殖并提高LDH釋放量。提示ponatinib和perifosine可能是抗PDAC的候選藥物。
Ponatinib和perifosine抑制PDAC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡
3. Ponatinib和perifosine通過caspase-3/GSDME途徑觸發(fā)PDAC細(xì)胞焦亡
Ponatinib和perifosine以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞中caspase-3和GSDME的裂解，同時(shí)胞內(nèi)GSDME傾向定位于細(xì)胞膜。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，藥物治療后GSDME二聚體和寡聚體條帶明顯增加，證實(shí)ponatinib和perifosine不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)GSDME的裂解，還能誘導(dǎo)GSDME的寡聚化；此外，PANC-1和BxPC-3細(xì)胞經(jīng)ponatinib或perifosine處理后直接進(jìn)入annexin V和PI雙陽性階段，說明兩種化合物誘導(dǎo)的是焦亡而不是凋亡。進(jìn)一步分析表明ponatinib和perifosine主要通過激活caspase-3/GSDME途徑引起PDAC細(xì)胞焦亡。
ponatinib和perifosine通過caspase-3/GSDME途徑觸發(fā)PDAC細(xì)胞焦亡
4. Perifosine和sorafenib抑制異種移植物腫瘤生長，誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞焦亡
作者利用PANC-1異種移植腫瘤模型，以驗(yàn)證perifosine在體內(nèi)的抗PDAC活性，結(jié)果表明perifosine以劑量依賴的方式減輕了PANC-1腫瘤負(fù)荷，并上調(diào)了caspase-3和GSDME的表達(dá)，免疫熒光圖像也證實(shí)perifosine提高了腫瘤組織細(xì)胞中cleaved caspase-3的蛋白水平。重要的是，作者首次發(fā)現(xiàn)sorafenib也通過焦亡對胰腺癌產(chǎn)生類似的抑制作用，表明perifosine和sorafenib可能通過誘導(dǎo)GSDME介導(dǎo)的焦亡來抑制PDAC腫瘤的體內(nèi)生長。最后，作者將AAV-shGSDME或AAV-shC注射到PANC-1 GSDME WT細(xì)胞形成的皮下腫瘤中，以降低腫瘤組織中GSDME的表達(dá)，結(jié)果顯示瘤內(nèi)敲低GSDME后，perifosine對PANC-1異種移植腫瘤生長的抑制作用大大減弱。此外，經(jīng)perifosine處理的AAV-shC組血清LDH水平、GSDME-N和cleaved caspase-3水平均顯著升高，并在敲低GSDME后得到逆轉(zhuǎn)。表明GSDME依賴性焦亡在perifosine治療PDAC中起關(guān)鍵作用。
Perifosine和sorafenib抑制異種移植物腫瘤生長，誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞焦亡
03 小結(jié)
綜上所述，hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)是一種定量、高通量鑒定化療藥物致細(xì)胞焦亡活性的有力工具?；谠撓到y(tǒng)篩選出的抗癌藥物ponatinib和perifosine，通過caspase-3/GSDME途徑促進(jìn)PDAC細(xì)胞的焦亡，從而抑制胰腺癌進(jìn)展。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)在開發(fā)抗PDAC藥物中的重要性。