研究背景
肝細胞核因子4α(HNF4α)下調是肝細胞癌（HCC）發病機制中的一個關鍵事件，但在HCC中的降解機制仍不清楚。三聯基序47(TRIM47)是TRIM家族的典型E3泛素連接酶，與多種腫瘤有關，其在HCC進展中的具體作用尚未完全闡明。近期海軍軍醫大學第二附屬醫院（上海長征醫院）謝渭芬、張新、王珂琪團隊在Acta Pharmaceutica Sinica B (IF 14.6)上發表文章“Blocking TRIM47-mediated HNF4α degradation suppresses hepatocellular carcinoma progression”，發現TRIM47通過靶向HNF4α進行泛素-蛋白酶體降解來促進肝細胞癌進展。
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基因信息 HNF4α：肝細胞核因子4α
病毒產品 Ad-HNF4α (K470R)
體外感染細胞 Huh7細胞
體內實驗動物 Huh7細胞異種移植裸鼠
體內注射方式 瘤內注射
體內病毒用量 2×109 pfu
結果展示
1. TRIM47與HNF4α相互作用并負向調節其在HCC細胞中的功能
作者發現HCC樣本中TRIM47水平顯著升高，并且這種上調與較短的總生存期相關。免疫共沉淀結合質譜分析發現HNF4α是TRIM47的潛在靶點，原位鄰近連接和Co-IP實驗證明HNF4α與TRIM47存在相互作用。由于HNF4α是HCC的關鍵調節劑和治療靶點，作者進一步研究了TRIM47在調節HNF4α功能中的作用。熒光素酶報告基因檢測表明，TRIM47過表達顯著抑制HNF4A轉錄活性，而TRIM47敲低則增強其轉錄活性；qRT-PCR分析證實TRIM47的過表達抑制了HCC細胞中HNF4A靶基因的表達，但TRIM47敲低上調了HNF4A靶基因，同時HNF4A耗竭則消除了這些轉錄變化。這些結果表明TRIM47對HNF4A功能的抑制作用。機制研究發現TRIM47通過介導K48連接的HNF4α泛素化和蛋白酶體降解，抑制HNF4α的蛋白水平。
圖1 TRIM47與HNF4α相互作用并負向調節其在HCC細胞中的功能
2. 阻斷HNF4α的泛素化可減輕TRIM47對HCC的有害影響
泛素測定顯示，HNF4α的K470R突變顯著降低了TRIM47介導的HNF4α泛素化，此外K470R突變延遲了CHX處理的過表達TRIM47的Huh7細胞中HNF4α的降解，導致HNF4α蛋白水平恢復。熒光素酶報告基因檢測表明，K470R突變顯著恢復了TRIM47介導的HNF4α轉錄活性抑制。鑒于TRIM47介導HNF4α的降解，作者研究了抑制這種降解是否可以減弱TRIM47驅動的HCC進展。使用Ad-HNF4α和Ad-HNF4α-K470R感染TRIM47過表達的Huh7細胞，發現TRIM47對增殖、遷移、侵襲和集落形成的促進作用被HNF4α-K470R消除了。裸鼠皮下移植實驗發現AdHNF4α-K470R逆轉了TRIM47誘導的腫瘤生長、體積和重量的增加。蛋白質印跡和IHC分析顯示，HNF4α蛋白水平因TRIM47過表達而降低，但被Ad-HNF4α-K470R恢復。Ki67的IHC染色進一步支持Ad-HNF4α-K470R強烈抑制TRIM47誘導的小鼠腫瘤增殖。這些數據表明，通過突變K470來阻斷HNF4α泛素化可有效穩定HNF4α，從而阻止TRIM47加重的HCC的進展。
圖2 阻斷HNF4α的泛素化可減輕TRIM47對HCC的有害影響
3. CZ-2401治療可改善TRIM47驅動的HCC進展
通過虛擬篩選和藥理活性驗證，作者發現CZ-2401是TRIM47-HNF4α相互作用的有效抑制劑，能阻斷HNF4α-TRIM47相互作用，增強HNF4α穩定性。然后作者評估了CZ-2401對體外過表達TRIM47的Hep3B細胞的影響。發現CZ-2401處理顯著減弱了TRIM47對細胞增殖、遷移、侵襲和集落形成的刺激作用，流式細胞術進一步證實CZ-2401抑制HCC細胞增殖并誘導其凋亡，增強其抗腫瘤功效。作者還建立了小鼠異種移植模型，發現TRIM47過度表達加劇了異種移植物中的腫瘤生長，但CZ-2401治療顯著減弱了這種效應。作者進一步評估了異種移植腫瘤中HNF4α的表達，發現TRIM47過表達組的HNF4α蛋白水平顯著降低，相反，在TRIM47過表達的情況下，CZ-2401治療也會導致HNF4α水平顯著增加。Ki-67染色的IHC進一步證實了CZ-2401對TRIM47加速的腫瘤細胞增殖的抑制作用。這些數據表明CZ-2401顯示出良好的HCC治療的潛力。
圖3 CZ-2401治療可改善TRIM47驅動的HCC進展
實驗結論
本研究發現TRIM47靶向HNF4α進行泛素-蛋白酶體降解來促進肝細胞癌進展，HNF4α賴氨酸470處泛素化位點的突變顯著阻礙腫瘤生長。抑制TRIM47-HNF4α相互作用的小分子化合物CZ-2401可在體外和體內有效抑制腫瘤進展，使CZ-2401成為未來HCC治療的潛在先導化合物。