NAT COMMUN（IF17.694）｜南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs有望成為慢性腎臟病治療新靶點(diǎn)！
慢性腎臟疾病(CKD)困擾著全世界10%的成年人，目前尚無有效的治療方法，腎間質(zhì)纖維化是該病的主要病理特征之一。新近的研究表明，腎損傷引起腎細(xì)胞發(fā)生代謝重編程，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞去分化和肌成纖維細(xì)胞激活，這種代謝重編程促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化，并促進(jìn)CKD的發(fā)展。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）的慢性激活可促進(jìn)各種病理?xiàng)l件下的代謝重編程，但其調(diào)節(jié)間質(zhì)纖維化激活的機(jī)制在很大程度上仍然未知。 2023年3月11日，南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院張躍/黃松明/賈占軍/張愛華團(tuán)隊(duì)在Nature Communications?(IF?17.694)發(fā)表題為“DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) drives chronic kidney disease progression in male mice”的文章。 在這項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)在慢性腎臟病（CKD）患者以及雄性小鼠單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）和單側(cè)缺血再灌注（UIR）損傷誘導(dǎo)的腎臟組織中DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基DNA-PKcs的表達(dá)均顯著升高，體內(nèi)外抑制DNA-PKcs可糾正CKD中受損上皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的代謝重編程。機(jī)制上，DNA-PKcs在CKD中通過磷酸化TATA-box結(jié)合蛋白相關(guān)因子7 (TAF7)介導(dǎo)RAPTOR/mTORC1信號(hào)的激活。因此，在CKD中可以通過TAF7/ mTORC1信號(hào)通路抑制DNA-PKcs以糾正代謝重編程，并作為治療CKD的潛在靶點(diǎn)。 基因信息 DNA依賴性蛋白激酶催化亞基， 病毒產(chǎn)品 AAV8-U6-gRNA-DNA-PKcs； AAV8-U6-gRNA 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6-8周齡雄性Kap+Cas9+小鼠 病毒用量 5×10E11 GC 注射方式 腎包膜下注射 
DNA-PKcs
1 研究結(jié)果
1、DNA-PKcs介導(dǎo)小鼠CKD進(jìn)展
實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DNA-PKcs在CKD患者和腎纖維化小鼠的腎臟中表達(dá)上調(diào)。作者構(gòu)建了DNA-PKcs敲除小鼠，并給予小鼠UUO處理，與WT小鼠相比，DNA-PKcs的敲除明顯改善了UUO誘導(dǎo)的腎小管結(jié)構(gòu)障礙及腎纖維化，同時(shí)顯著降低UUO誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子上調(diào)。UUO造成了WT小鼠梗阻腎內(nèi)巨噬細(xì)胞的大量浸潤，而DNA-PKcs敲除后巨噬細(xì)胞浸潤明顯減少。接著，作者將靶向DNA-PKcs的AAV8-sgRNA以腎包膜下注射的方式注入Kap+ Cas9+ 小鼠腎臟，進(jìn)一步構(gòu)建了近端腎小管上皮細(xì)胞DNA-PKcs特異性敲除小鼠（DNA-PKcsTEC KO），3周后進(jìn)行UUO手術(shù)，Western blot分析顯示，DNA-PKcsTEC KO小鼠腎臟中DNA-PKcs和促纖維化標(biāo)志物蛋白水平顯著降低。與UUO模型類似，DNA-PKcs敲除小鼠也能免受UIR誘導(dǎo)的CKD。這些結(jié)果表明，DNA-PKcs缺失可以減弱小鼠CKD進(jìn)展。
圖1. DNA-PKcs缺失減弱了小鼠CKD進(jìn)展
2、體內(nèi)給藥DNA-PKcs抑制劑NU7441可減弱小鼠CKD進(jìn)展
基于上述結(jié)果，作者假設(shè)DNA-PKcs抑制劑可以用于預(yù)防腎纖維化。對(duì)進(jìn)行UUO手術(shù)的WT小鼠每天給予DNA-PKcs高特異性抑制劑NU7441治療，免疫組化染色分析顯示NU7441的給藥顯著抑制UUO腎組織DNA-PKcs的激活，并且NU7441處理后UUO誘導(dǎo)的腎小管結(jié)構(gòu)障礙和腎間質(zhì)纖維化均得到明顯改善；與對(duì)照相比，NU7441處理后UUO小鼠腎組織巨噬細(xì)胞浸潤也顯著減少。此外，作者發(fā)現(xiàn)NU7441在DNA-PKcs敲除小鼠中沒有明顯的抗纖維化作用，表明NU7441對(duì)DNA-PKcs具有特異性作用。同樣地，NU7441治療也能改善UIR誘導(dǎo)的腎損傷和纖維化。這些結(jié)果表明，NU7441抑制DNA-PKcs活性，可以減弱小鼠CKD進(jìn)展。
圖2. DNA-PKcs抑制劑NU7441的處理可減弱小鼠CKD進(jìn)展
3、體外抑制DNA-PKcs活性可保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞表型，調(diào)節(jié)間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活
腎損傷會(huì)引起腎小管上皮細(xì)胞去分化和肌成纖維細(xì)胞激活，這是CKD發(fā)病機(jī)制中的核心事件。TGF-β1是間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵介導(dǎo)因子，作者發(fā)現(xiàn)在TGF-β1處理的HK-2細(xì)胞中，DNA-PKcs磷酸化水平和總蛋白水平顯著上調(diào)，進(jìn)一步研究表明，敲除DNA-PKcs或添加NU7441抑制劑均可以改善TGF-β1誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞去分化。不僅如此，TGF-β1處理也上調(diào)了腎成纖維細(xì)胞（NRK-49F）中的DNA-PKcs磷酸化和總蛋白水平。免疫染色顯示，在NRK-49F細(xì)胞中，TGF-β1處理顯著誘導(dǎo)DNA-PKcs活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞激活和肌成纖維細(xì)胞分化，而NU7441處理則得到了與之相反的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，抑制DNA-PKcs可以保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞表型，并調(diào)節(jié)間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活。
圖3. 體外抑制DNA-PKcs可以保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞表型，調(diào)節(jié)間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活
4、DNA-PKcs通過TAF7介導(dǎo)的RAPTOR表達(dá)上調(diào)促進(jìn)mTORC1的激活
作者證實(shí)DNA-PK通過介導(dǎo)TAF7磷酸化加重腎纖維化，為了進(jìn)一步探討TAF7的促纖維化作用機(jī)制，研究人員進(jìn)行了RNA-Seq。相關(guān)分析表明，TGF-β1處理后mTOR信號(hào)通路顯著上調(diào)，而TAF7敲除后mTOR信號(hào)通路則明顯下調(diào)。同時(shí)，TGF-β1處理還增加了mPTC細(xì)胞中mTORC1磷酸化水平及其正調(diào)節(jié)因子RPTOR (RAPTOR)的蛋白水平，而敲除TAF7后則與之相反。此外，作者發(fā)現(xiàn)無論是過表達(dá)DNA-PKcs還是TAF7，RPTOR蛋白水平和mTOR磷酸化水平均升高。這些結(jié)果表明DNA-PKcs介導(dǎo)的TAF7磷酸化通過上調(diào)RPTOR的表達(dá)來促進(jìn)mTORC1的激活。
圖4. DNA-PKcs通過TAF7介導(dǎo)的RAPTOR表達(dá)上調(diào)促進(jìn)mTORC1的激活
5、抑制DNA-PK或TAF7可以糾正腎細(xì)胞代謝重編程
先前的研究表明，mTORC1的異常激活通過介導(dǎo)纖維化腎的代謝重編程促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展，因此作者研究了抑制DNA-PK或TAF7是否能糾正纖維化腎臟的代謝重編程。通過對(duì)TGF-β1處理的NC和TAF?/?mPTC細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq分析，作者發(fā)現(xiàn)代謝信號(hào)通路是兩種mPTC細(xì)胞之間表達(dá)差異最大的通路之一。與NC對(duì)照細(xì)胞相比，TAF7敲除mPTC細(xì)胞經(jīng)TGF-β1處理后氧化磷酸化和脂肪酸氧化途徑顯著上調(diào)，糖酵解途徑顯著減少，表明TAF7缺失可以糾正TGF-β1誘導(dǎo)的mPTC細(xì)胞代謝重編程。另一方面，敲除DNA-PKcs可明顯改善UUO誘導(dǎo)的WT小鼠氧化磷酸化和脂肪酸代謝異常，并抑制糖酵解途徑。最后，使用代謝組學(xué)分析進(jìn)一步說明抑制DNA-PK或TAF7可以糾正由損傷或TGF-β1引起的腎細(xì)胞代謝重編程。
圖5. 抑制DNA-PK或TAF7可以糾正代謝重編程
2 結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs通過磷酸化TAF7介導(dǎo)RAPTOR/mTORC1信號(hào)的激活，并糾正受損上皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的代謝重編程，表明靶向DNA-PKcs可能是治療慢性腎臟疾病的潛在治療策略。
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