研究背景
N6-甲基腺苷（m6A）修飾是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制，也是真核生物中最豐富、最保守的RNA表觀遺傳修飾。之前的研究表明m6A修飾參與多種組織再生過程，包括肝臟再生。VIRMA是一種具有強(qiáng)大甲基化能力的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶。然而，其在肝臟再生中的作用仍然知之甚少。近期，四川大學(xué)華西醫(yī)院曾勇教授、陳向征副研究員團(tuán)隊(duì)在Acta Pharmaceutica Sinica B (IF 14.6)上發(fā)表文章“VIRMA-mediated SHQ1 m6A modification enhances liver regeneration through an HNRNPA2B1-dependent mechanism”，發(fā)現(xiàn)VIRMA通過調(diào)節(jié)m6A修飾在促進(jìn)肝臟再生方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為肝臟再生期間的表觀遺傳調(diào)節(jié)提供了有價(jià)值的見解。
· 維真助力 - 慢病毒和質(zhì)粒 ·
基因信息 Virma：Vir樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白；Shq1：H/ACA核糖核蛋白組裝因子
病毒產(chǎn)品 Lv-Virma、Lv-Shq1
質(zhì)粒產(chǎn)品 Virma質(zhì)粒、Shq1質(zhì)粒、Shq1-MUT質(zhì)粒
感染細(xì)胞 AML12細(xì)胞
WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證慢病毒介導(dǎo)的VIRMA在AML12細(xì)胞過表達(dá)
結(jié)果展示
1. Virma影響AML12的增殖能力
作者發(fā)現(xiàn)ALPPS手術(shù)后肝臟再生期間VIRMA升高，ALPPS和CCl4動(dòng)物模型中VIRMA敲除抑制肝臟再生，表明Virma在肝細(xì)胞增生和肝臟再生中的關(guān)鍵作用。之后作者評(píng)估了Virma敲低后AML12細(xì)胞的增殖能力，CCK-8增殖試驗(yàn)、集落形成試驗(yàn)和EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Virma敲減顯著抑制了AML12細(xì)胞的增殖活性。此外，作者使用慢病毒在AML12細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)Virma，并進(jìn)一步評(píng)估了其增殖能力，發(fā)現(xiàn)Virma過表達(dá)顯著增強(qiáng)AML12細(xì)胞的增殖，還對(duì)AML12細(xì)胞的凋亡過程產(chǎn)生顯著影響。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，Virma敲低增加了AML12細(xì)胞的細(xì)胞死亡率，而Virma的過表達(dá)則有效降低了細(xì)胞死亡率。這些結(jié)果表明Virma不僅在促進(jìn)AML12細(xì)胞的增殖方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而且還對(duì)維持細(xì)胞生存發(fā)揮著保護(hù)作用。
圖1. VIRMA促進(jìn)AML12細(xì)胞的增殖
2. SHQ1是VIRMA m6A修飾的下游靶點(diǎn)
鑒于VIRMA是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的重要組成部分，作者進(jìn)一步探索了VIRMA在促進(jìn)肝臟再生方面的下游靶點(diǎn)。MeRIPseq發(fā)現(xiàn)Virma缺失主要影響肝臟再生過程中的DNA重組、細(xì)胞周期和細(xì)胞群繁殖等過程，并在此基礎(chǔ)上確定了Virma的19個(gè)潛在下游靶基因，其中Shq1和Adck2在ALPPS手術(shù)后上調(diào)，在Virma敲除后下降。為了識(shí)別Virma潛在的直接下游基因，作者進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，并觀察到被VIRMA抗體拉下的產(chǎn)物中Shq1 mRNA顯著富集，但Adck2 mRNA沒有顯著富集。蛋白印記實(shí)驗(yàn)顯示Virma-KO小鼠中SHQ1蛋白表達(dá)水平顯著降低，且體外實(shí)驗(yàn)表明敲低VIRMA會(huì)降低AML12細(xì)胞中SHQ1蛋白表達(dá)水平，但過表達(dá)VIRMA會(huì)增加SHQ1水平。此外Virma敲除導(dǎo)致Shq1 mRNA的穩(wěn)定性降低，而Virma過表達(dá)增強(qiáng)了Shq1 mRNA的穩(wěn)定性，這些數(shù)據(jù)表明，VIRMA充當(dāng)SHQ1的上游調(diào)節(jié)因子，通過穩(wěn)定SHQ1的mRNA來調(diào)節(jié)SHQ1的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明Virma對(duì)Shq1表達(dá)的調(diào)節(jié)取決于m6A修飾。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SHQ1通過AKT激活依賴性機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增生，而VIRMA的喪失通過抑制SHQ1表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。
圖2. SHQ1是VIRMA m6A修飾的下游靶點(diǎn)
3. VIRMA通過增強(qiáng)SHQ1表達(dá)促進(jìn)肝臟再生
為了確認(rèn)SHQ1是否是VIRMA在體內(nèi)促進(jìn)肝臟再生的主要因素，作者評(píng)估了SHQ1的引入是否可以挽救Virma敲除對(duì)肝臟再生的有害影響。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Shq1的小鼠中，Virma敲除引起的肝臟再生率降低顯著逆轉(zhuǎn)。此外SHQ1的過表達(dá)有效逆轉(zhuǎn)了Virma敲除導(dǎo)致的肝臟功能的血清標(biāo)志物（包括ALT、AST和TBIL）升高。肝再生標(biāo)志物Ki67、BrdU和p-H3S10的免疫組織化學(xué)分析表明，SHQ1的過表達(dá)有效逆轉(zhuǎn)了Virma敲除引起的這些標(biāo)志物的減少。HE染色進(jìn)一步證明SHQ1過表達(dá)有效地恢復(fù)了有絲分裂活性?？傮w而言，本研究發(fā)現(xiàn)在肝臟再生過程中，VIRMA通過促進(jìn)其m6A修飾來上調(diào)SHQ1的表達(dá)。在這一機(jī)制中，HNRNPA2B1作為能夠識(shí)別和結(jié)合m6A修飾的Shq1 mRNA的“閱讀器”，進(jìn)一步增強(qiáng)了Shq1 mRNA的穩(wěn)定性，導(dǎo)致SHQ1蛋白表達(dá)水平增加。這些結(jié)果表明SHQ1表達(dá)的上調(diào)激活了PI3K/AKT信號(hào)途徑，這對(duì)于促進(jìn)肝臟再生至關(guān)重要。
圖3. VIRMA通過增強(qiáng)SHQ1表達(dá)促進(jìn)肝臟再生
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)ALPPS手術(shù)和急性損傷后，m6A修飾與補(bǔ)償性肝再生之間密切相關(guān)。在肝臟再生的早期階段，肝臟中VIRMA表達(dá)的增加與肝細(xì)胞增生增加和細(xì)胞周期進(jìn)程加速相關(guān)。在機(jī)制上VIRMA的缺失導(dǎo)致Shq1 mRNA的m6A修飾減少，導(dǎo)致其mRNA穩(wěn)定性降低，隨后SHQ1表達(dá)下調(diào)。此外，SHQ1的下調(diào)會(huì)抑制PI3K/AKT途徑，從而抑制肝細(xì)胞增生并最終阻礙肝臟再生。這些發(fā)現(xiàn)揭示了VIRMA的新生物學(xué)功能，并為肝再生的潛在干預(yù)策略提供了新的見解。