結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRLM）是結(jié)直腸癌（CRC）最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移類型，約50%的CRC患者會(huì)發(fā)生CRLM，多數(shù)患者無(wú)法手術(shù)，5年生存率僅14%。CRLM的特征是具有免疫抑制性微環(huán)境，且對(duì)免疫治療的反應(yīng)不佳。值得注意的是，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且在CRLM中表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。鞘氨醇激酶1（SPHK1）作為一種關(guān)鍵激酶，在維持神經(jīng)酰胺和鞘氨醇-1-磷酸（S1P）水平的平衡中起重要作用。然而，在CRLM過(guò)程中，TAMs中的SPHK1在腫瘤免疫逃逸中所發(fā)揮的作用仍不明確。
近期，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科方媛團(tuán)隊(duì)在Cancer Communications (IF 24.9)發(fā)表題為“Targeting SPHK1 in macrophages remodels the tumor microenvironment and enhances anti-PD-1 immunotherapy efficacy in colorectal cancer liver metastasis”的文章。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)，TAMs中的SPHK1通過(guò)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞功能異常和形成免疫抑制性微環(huán)境，在CRLM的進(jìn)展中發(fā)揮作用，將SPHK1阻斷與抗PD-1療法相結(jié)合，可能是CRLM患者一種有前景的治療方案。
· 維真助力 - AAV、LV及質(zhì)粒 ·
In vivo
基因信息 鞘氨醇激酶1（Sphk1）
病毒產(chǎn)品 AAV-Sphk1
病毒用量 2 µL/mouse（5×1010 vg/mL）
注射方式 尾靜脈注射
In vitro
病毒產(chǎn)品 LV-Sphk1（mouse）、LV-shSPHK1（human）
LV-shSphk1（mouse）、LV-shAdam17（mouse）
病毒滴度 1×108 TU/mL
感染細(xì)胞 THP-1細(xì)胞；MC38細(xì)胞
MOI 10
質(zhì)粒產(chǎn)品 Human/mouse S1PR2、human HIF1A過(guò)表達(dá)質(zhì)粒
01 研究方法與結(jié)果
1、SPHK1通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境發(fā)揮促腫瘤作用
通過(guò)對(duì)公共RNA-seq和scRNA-seq等數(shù)據(jù)的分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SPHK1在來(lái)自CRLM的TAM中高度表達(dá)，并且與CRC患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。通過(guò)藥物抑制或基因敲除TAMs中的SPHK1，可減少CRLM模型中小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量和直徑，延長(zhǎng)其生存期；同時(shí)，SPHK1的抑制或敲除會(huì)降低肝腫瘤中S1P的水平，表明靶向TAMs中的SPHK1能有效抑制CRLM進(jìn)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TAMs中SPHK1缺失后，CRLM模型小鼠的TME免疫抑制狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，具體表現(xiàn)為肝轉(zhuǎn)移腫瘤中TAMs比例減少，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞比例增加；CD8+T細(xì)胞的耗竭標(biāo)志物（如PD-1、LAG3）表達(dá)降低，效應(yīng)分子（如IFN-γ）及激活標(biāo)志物（如CD44、CD25）表達(dá)升高。隨后，研究團(tuán)隊(duì)將慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)THP1細(xì)胞，建立SPHK1穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系，體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，SPHK1缺失的巨噬細(xì)胞可減少CD8+T細(xì)胞耗竭并增強(qiáng)其抗腫瘤活性，且該效應(yīng)依賴于TAMs和CD8+T細(xì)胞的存在。
TAMs中SPHK1缺陷逆轉(zhuǎn)CRLM的免疫抑制性TME
2、SPHK1-S1P軸通過(guò)NLRP3炎性體促進(jìn)TAMs分泌IL-1β
RNA-seq數(shù)據(jù)分析顯示SPHK1-S1P軸增強(qiáng)IL-1β和NLRP3的mRNA表達(dá)。通過(guò)GSEA確定了SPHK1-/-TAM和SPHK1敲低CRC中NLRP3炎性體通路的顯著下調(diào)。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)S1P可上調(diào)BMDM和THP-1來(lái)源TAMs中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，而敲低SPHK1則會(huì)減少這些蛋白的表達(dá)。此外，CRC細(xì)胞與活化的CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)可通過(guò)IFN-γ促進(jìn)TAMs中SPHK1磷酸化以及IL-1β和NLRP3的表達(dá)。提示TAMs中CD8+T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)SPHK1-NLRP3-IL-1β軸，這一過(guò)程可能參與CRLM的適應(yīng)性免疫逃避。隨后利用AAV-SPHK1將SPHK1導(dǎo)入TAMs，導(dǎo)致小鼠肝轉(zhuǎn)移灶增加，而IL-1β拮抗劑可逆轉(zhuǎn)這一效果。這些數(shù)據(jù)表明TAM中的SPHK1通過(guò)IL-1β介導(dǎo)的免疫抑制促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移進(jìn)展。進(jìn)一步的機(jī)制探索證實(shí)S1P-S1PR2軸通過(guò)NF-κB和HIF-1α信號(hào)通路激活NLRP3炎性體。
SPHK1-S1P軸通過(guò)NLRP3炎性體促進(jìn)TAMs中IL-1β的分泌
3、rIL-1β處理的CRC細(xì)胞促進(jìn)TAM募集和CD8+T細(xì)胞功能障礙
細(xì)胞因子陣列顯示，SPHK1敲低的THP-1細(xì)胞與HCT116細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，上清中CCL2水平顯著降低，而IL-2水平升高；TAMs中CCL2表達(dá)不受SPHK1調(diào)控或S1P預(yù)處理影響，但與SPHK1敲除/敲低巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的 CRC細(xì)胞中，單核細(xì)胞趨化因子（CCL2、CCL7、CCL8、CXCL12）水平顯著降低。重組IL-1β（rIL-1β）可顯著上調(diào)CRC細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化因子的表達(dá)；Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，SPHK1缺陷顯著抑制與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的巨噬細(xì)胞遷移，且SPHK1-/-肝腫瘤中CCL2表達(dá)較低。這些數(shù)據(jù)表明，表達(dá)SPHK1的TAM促進(jìn)IL-1β分泌，然后與CRC細(xì)胞相互作用，以招募更多的TAM進(jìn)入TME。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，rIL-1β處理的MC38細(xì)胞分泌組中ADAM17及多種單核細(xì)胞趨化因子富集，ELISA證實(shí)rIL-1β可誘導(dǎo)ADAM17分泌，且IL-1β與ADAM17 表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步的分析表明SPHK1+TAMs通過(guò)IL-1β誘導(dǎo)CRC細(xì)胞釋放ADAM17，從而限制CD8+T細(xì)胞的運(yùn)輸和抗腫瘤活性。聯(lián)合治療效果評(píng)估發(fā)現(xiàn)，SPHK1靶向治療可增強(qiáng)抗PD-1免疫治療的療效，聯(lián)合治療能顯著抑制CRLM，減少肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，延長(zhǎng)小鼠生存期，且與放療聯(lián)合時(shí)效果更優(yōu)，同時(shí)可降低放療導(dǎo)致的肝損傷。
rIL-1β處理的CRC細(xì)胞促進(jìn)TAM募集和CD8+T細(xì)胞功能障礙
02 總結(jié)
本研究揭示SPHK1在TAMs中通過(guò)S1P-NLRP3-IL-1β 通路促進(jìn)CRLM的腫瘤免疫微環(huán)境的形成，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞功能障礙和免疫治療耐藥。強(qiáng)調(diào)聯(lián)合靶向SPHK1與抗PD-1治療是CRLM的潛在有效治療策略。