- 蛋白質印跡法
在顯影過程中，較為簡單也是目前科研中最為常用的方法是ECL化學發光法，發表文章時大都也選擇這種方法。ECL（electrochemiluminescence）是一種化學發光試劑，一般是Western blot實驗中的最后一步，需要1：1混合溶液A和溶液B（一般使用的發光液A和B分別為魯米諾和過氧化氫），混合液均勻覆蓋PVDF膜，成像儀曝光后可顯色觀察實驗結果。
魯米諾是一種重要的化學發光試劑，它的氧化反應需要在堿性緩沖液中進行，在過氧化氫存在下形成激發態中間體，當回到基態時發光，波長為425nm。早期是使用魯米諾直接標記抗原/抗體，但近年來已改用過氧化物酶標記抗體，以魯米諾作為發光底物，Kodak Am erliteTM半自動分析系統就是利用這一體系專門設計的。
ECL化學發光法檢測辣根過氧化酶（HRP）的原理如下：辣根過氧化物酶在過氧化氫存在的條件下，氧化化學發光底物魯米諾并產生激發光，在化學增強劑的作用下，光信號可被放大數千倍，隨后采用X膠片或成像儀檢測即可。ECL方法的特點為操作簡便、靈敏度高、線性范圍廣等。
- Western Blot常見問題及解決方法
| 原因分析 | 推薦解決方法 |
| 轉膜的效率低 | 用預染色分子量標準來判斷，提高轉膜效率 |
| 抗原/抗體量少或不匹配 | 增加抗原/抗體量或選擇合適抗原/抗體 |
| X光膠片有問題 | X光片洗片以后應當為透明的膠片，如果全黑則說明 已經完全曝光了，應當廢棄 |
| 定顯影液有問題 | 可以先曝光一張膠片來驗證，若有問題及時更換新 的定顯影液 |
| 反應系統中HRP量過多 | 稀釋HRP標記物 |
問題2：X 光膠片背景臟， 或者出現“一片黑”
| 原因分析 | 推薦解決方法 |
| 一抗、二抗濃度太高 | 降低抗體濃度，延長封閉時間；或將ECL工作液用去 離子水稀釋2-5倍后使用 |
| 抗體未清洗干凈 | 增加洗膜次數 |
問題3：條帶有空斑
| 原因分析 | 推薦解決方法 |
| 轉膜時有氣泡 | 在搭建“三明治”結構時盡量驅趕氣泡 |
| 轉印膜沒有水化均勻 | 充分激活轉印膜 |
問題4：帶型不規則
| 原因分析 | 推薦解決方法 |
| SDS-PAGE凝膠配制不均 | 充分混勻后再進行灌膠制膠 |
| 跑膠時電壓不穩 | 確認電泳槽兩級接觸正常以及跑膠時保存靜置 |
- Biodragon增強型ECL化學發光試劑盒
產品基于魯米諾底物的化學發光試劑盒，能夠被辣根過氧化物酶（HRP）催化，發 出強烈輝光，檢測靈敏度達到 pg 級。本試劑盒優化了底物組成，使用了新型高效增強劑， 發光強度比傳統 ECL 顯色液提高了 30-100 倍，并有效地降低了背景。試劑盒使用新的氧化 劑代替不穩定的H2O2，提高了試劑盒的穩定性，室溫可穩定放置 1 年。工作液被 HRP 催化后，發出特定波長熒光（400-450nm），可對 X 光膠片曝光，也可直接使用熒光 CCD 掃描， 主要應用于 Western 檢測以及化學發光免疫檢測系統。 超敏型的靈敏度比增強型高 10 倍以上（見下圖），對于增強型無法檢測的微量樣品，可以選擇超敏型。
2、溶液配制
（1）一抗工作濃度：0.2-1.0 μg/ml；
（2） HRP 標記二抗工作濃度：10-500 ng/ml，根據二抗效價調整。
（3） 發光檢測工作液的配制：Solution I : Solution II = 1:1（10 cm2 轉印膜使用 1-2 ml 工作液）
抗體去除液（用于膜的再生）
基本型：0.1M 甘氨酸，HCl 調整 pH 至 2.7
傳統型：2% SDS, 0.1M mercaptoethanol, 50mM Tris-HCl, pH 7.0
高效型：6M GuHCl, 0.2% Nonidet P-40 (NP-40), 0.1M β-mercaptoethanol, 20mM Tris-HCl, pH7.5
3、操作步驟
根據常規操作轉印結束后，進行封閉、一抗孵育、二抗孵育以及必要的洗膜步驟，根據膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等體積溶液 I 和溶液 II 混勻，配制成發光檢測工作液。用平頭鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體。用移液器將工作液加到轉印膜上，使其均勻覆蓋，室溫孵育 1-2 分鐘，此步驟可在潔凈保鮮膜上或塑料盒中完成。
3.1 X 光膠片法
（1）用平頭鑷子夾起轉印膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工 作液，不要讓膜完全干燥。膜的蛋白面朝上，包裹于潔凈保鮮膜內。輕輕趕出其間的氣 泡，用小塊透明膠帶粘住四角，固定在 X 光片暗盒內。
（2）在暗室中取一張 X 光膠片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光 30 秒至 1 分鐘。立即定影、顯影，根據曝光強度，調整下一張 X 光膠片的曝光時間。如果背景過高，可以使用兩 張 X 光膠片同時壓片。
3.2 熒光拍照法
（1）如果需要使用 CCD 拍照，可以將膜放置于工作液中，開機后按照使用說明，將轉印膜 取出，進行拍照。
（2）可以根據背景情況，調整機器測量參數，提高信噪比。
3.3 管式化學發光法
（1）將魯米諾的化學輝光檢測波長可設定在 420 nm 左右，可以選擇單點測量，或者取多次平均值。
（2）按照機器要求，將配制好的工作液加入到樣品管中，間隔一定時間測量發光強度，注意魯米諾系統的發光到達峰值有一定延遲（30-300 秒），不同樣本的測量時間間隔要固定。
（3）HRP 催化魯米諾發光的體系還受到反應溫度以及 pH 的強烈影響，所以工作試劑準備以及發光測量需要考慮到此類因素。
| 貨號（丁香通鏈接） | 名稱（官網鏈接） |
| BF06053-250 | 增強型ECl化學發光試劑盒 |
| BF06053-500 | 增強型ECl化學發光試劑盒 |
| BF06053S-250 | 超敏型ECl化學發光試劑盒 |
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| 名稱 | 貨號 | 規格 | 價格 |
| Western Blot膜再生液 | BF06019 | 100ml | 160 |
| BCA蛋白濃度測定試劑盒 | BTYA0301-500T | 500T | 360 |
| BCA蛋白濃度測定試劑盒 | BTYA0301-200T | 200T | 200 |
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| 30%Acr-Bis 29:1 | BTYA0311 | 500ml | 160 |
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