病毒轉染法是什么？
轉染是指將外源基因導入真核細胞內的一種實驗技術，隨著科技的發展目前可分為三大類：物理介導、化學介導、生物介導。物理介導方法包括電穿孔法、顯微注射及基因槍法；化學介導方法常見的有磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染法、陽離子物質介導等；生物介導方法包括原生質體轉染和應用較為廣泛的病毒載體介導轉染技術。
病毒轉染法是指在病毒的基礎上加以改造，使病毒載體能夠攜帶特定的外源目的基因，將其包裝成病毒顆粒后，通過侵染宿主細胞，使外源基因導入到細胞內。與傳統方法相比，病毒轉染在真核細胞中效率更高，尤其適用于常規方法難以轉染的原代細胞、活體細胞等。
Ⅰ、慢病毒載體簡介
慢病毒（Lentivirus）載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-Ⅰ）作為基礎設計出的病毒轉染載體，為二倍體RNA病毒，屬于逆轉錄病毒的一種。
HIV-Ⅰ基因組示意圖
慢病毒進入宿主細胞中后通過自身反轉錄酶作用，將病毒RNA反轉錄成cDNA。隨后利用cDNA作為模板，產生雙鏈DNA。經過雙鏈DNA的環化反應及病毒整合酶的作用，使得外源基因能夠在宿主細胞染色體上進行整合及穩定表達。
HIV復制過程示意圖
Ⅱ、慢病毒載體的優勢
1. 表達時間長：慢病毒載體能夠將外源基因整合到宿主細胞基因組上，隨著宿主細胞的增殖進行穩定表達，不容易丟失，因此常用于構建穩轉細胞系。
2. 安全可靠性高：目前暫未發現致病性，可用于基因治療中。
3. 宿主范圍廣，免疫原性低：慢病毒載體能夠有效感染腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、內皮細胞、干細胞等多種原代細胞及大部分細胞系。
Ⅲ、慢病毒包裝簡要流程
慢病毒包裝流程示意圖
??01 載體構建
在HIV-Ⅰ載體進行構建時，為了防止有復制能力的病毒形成，將HIV-Ⅰ的基因組拆分到各個質粒內，使這些質粒共轉染細胞之后只具有一次感染細胞的能力，而不產生具有復制能力的HIV-Ⅰ病毒顆粒。目前應用較為廣泛的是三質粒表達系統，包括包裝質粒、包膜質粒、目的質粒。
三質粒表達系統載體結構示意圖
??02 細胞準備
轉染前一天，胰酶消化傳代至培養皿，并使細胞貼壁后生長至密度達到80%-90%。在細胞培養的過程中，需要注意支原體污染問題。被支原體污染的細胞，細胞形態不會發生明顯的變化，培養基也不會發生渾濁，因此不容易被發現。但支原體會對細胞的生長狀態、免疫、代謝、病毒增殖和感染率等多方面造成影響。
支原體污染可通過PCR方法進行檢測，biodragon支原體檢測試劑盒（貨號：BDXB0087）靈敏度高、操作簡單、檢測范圍廣，通過對支原體基因組保守區域設計引物，利用PCR技術，可檢測多種常見的支原體。
常見支原體PCR擴增產物大小（bp）
通過PCR擴增，若出現陽性條帶，則細胞有可能受到支原體污染，此時可選擇biodragon支原體清除試劑盒（貨號：BDXB0112），本品含有兩種抗支原體成分，對多種不同的細胞系的支原體污染都有很強的清除功效，并且對正常細胞的生長無影響，其作用機理是通過干擾支原體DNA復制、干擾核糖體的轉錄來抑制支原體蛋白質的合成來達到清除支原體的目的，可用于實驗室以及疫苗生產中所培養細胞的支原體污染的清除及預防。
??03 共轉染細胞
包裝質粒、包膜質粒、目的質粒共轉染293T細胞，5%CO2恒溫培養箱37℃孵育。
三質粒系統轉染示意圖
??04 收獲病毒
孵育細胞18h后更換培養液以去除轉染試劑，繼續培養24h后收獲上清病毒液，同時更換新鮮的收獲培養基，繼續培養24h后，二次收獲病毒上清。每隔12h可重復上述病毒收獲過程，一般可以收集2-3次病毒，收集的病毒上清可根據需要進行合并。
??05 慢病毒的濃縮及純化
為了使慢病毒載體具有更強的細胞感染能力，一般我們需要對收集的病毒上清進行濃縮和純化，常見方法有以下兩種：
方法一：超速離心沉淀法
（1）收集細胞培養上清液，0.45μm 濾膜過濾，去除細胞和碎片。
（2）4℃，50000g高速離心2h，小心棄去上清后晾干，按照200ul/10cm培養基的比例加入PBS重懸沉淀，室溫靜置2h，用移液槍輕輕吹勻，室溫放置30min。分裝病毒至1.5ml離心管中，-80℃保存。
方法二：biodragon慢病毒濃縮試劑（貨號：BF06205）
（1）收集細胞培養上清液，0.45μm 濾膜過濾，去除細胞和碎片。
（2）將慢病毒上清液與試劑盒中的濃縮液按照體積比4:1的體積混合（上清液4份，濃縮液1份），混勻后4℃ 靜置，每隔30min 混勻一次，混勻共進行3次。4℃孵育2h 或過夜。
（3）4℃，4000g 離心30min。
（4）小心去除上清，不要劇烈晃動管子，一般可見白色沉淀（有時沉淀不可見）。
（5）用初始體積（原上清液體積）1/10 - 1/100的 DMEM 或 PBS 重懸病毒顆粒，小心吹打均勻，重懸沉淀物。
（6）重懸后的病毒以50μl/管分裝，-80℃冰箱保存。
??06 慢病毒滴度測定
病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒數量，滴度值可用于評估轉導一定數量的靶細胞所需的病毒量，常見方法有以下幾種：
（1）熒光染色法：慢病毒進行抗原-抗體顯色反應或通過慢病毒載體上攜帶的熒光標簽，利用熒光顯微鏡在相應的激發光波長下觀察熒光表達的情況。
（2）實時熒光定量PCR技術：利用基于SYBRGreen的實時熒光定量PCR技術，通過標準曲線對未知模板進行定量。通過Ct值與標準曲線對模板進行定量分析，并根據公式計算慢病毒滴度。
實時熒光定量PCR儀及qPCR結果圖
（3）ELISA檢測P24蛋白：P24蛋白是慢病毒外殼中含量最高的標志性蛋白，理論上檢測p24蛋白就可以對慢病毒滴度進行定量。根據此原理設計了biodragon慢病毒滴度ELISA檢測試劑盒（貨號：BF06203），通過雙抗體夾心法可定量檢測HIV-Ⅰ p24蛋白含量，適用于血清、培養上清等多種樣品中的慢病毒滴度檢測。
（4）慢病毒滴度快速檢測卡
Biodragon慢病毒滴度快速檢測卡（貨號：BF06202）是基于膠體金側向層析技術的 HIV-Ⅰ P24蛋白半定量檢測卡，可以用于相關慢病毒載體和假病毒包裝效率的快速評估。當樣品中 P24濃度變化時，檢測線顏色的深淺與 P24濃度呈正相關。僅需20ul細胞培養上清，靜待10-15min后，通過與比色卡比較，可半定量待檢標本中P24蛋白濃度，并大致估算慢病毒的滴度。
檢測卡顯色樣式
??07??????? 慢病毒感染目的細胞
經過上述驗證，合格的慢病毒可用于感染目的細胞，若病毒感染效率不高，可選擇biodragon慢病毒感染增強試劑（貨號：BDXB0113），產品可有效增強慢病毒對細胞的感染效率，且對細胞毒性極小。經 T 細 胞、MCF7、Raji 等多類細胞驗證結果表示，增強效果比不使用助感染試劑強 5-10 倍，本品增強效果優于 polybrene。
慢病毒增強試劑效果測試
相關產品
病毒包裝相關產品鏈接： https://biodragon.cn/bdbzsj/
關于我們
博奧龍是一家由留學歸國人員創辦的生命科學領域技術研發型企業，專業從事新型生化試劑的研發和銷售。公司理念是通過自主創新的品牌產品改變傳統實驗模式，使生命科學研究變得更輕松、更高效。
公司成立八年多來推出了上萬種自主品牌產品，其中包括QuickAntibody?免疫佐劑、QuickShuttle?轉染試劑、QuickFreezing?細胞凍存液、QuickVerification?膠體金檢測卡、Hybridoma Feeder添加因子和Pan-HPV? HPV L1抗體等多種獨特的自主知識產權產品。秉承“專業、創新”的理念，公司將繼續在擅長專業領域做強做大，為客戶提供更多的創新產品和服務，力爭成為國際知名的品牌生化試劑公司。
公司主要產品有抗體制備全套產品、病毒包裝相關產品、2萬多種科研用抗原抗體、近300種病理級抗體、近3000余種病毒蛋白及病毒抗體，另有WB、IHC、ELISA、細胞培養相關試劑及諸多特色產品和特色技術服務。
聯系我們
地址：
蘇州市工業園區金雞湖大道99號蘇州納米城西北區14幢203室
蘇州市相城區官塘路1號漕湖科技園C幢810室
郵編：100085
電話：400-921-8278
手機：13552826508/13616548830
網址：www.biodragon.cn
銷售郵箱：sales@biodragon.cn
技術支持：tech@biodragon.cn
QQ:
銷售1：1771650589
銷售2：1913771715
技術1：473644017
技術2：2181002590
QQ群：155578724
掃描二維碼關注我們