圖片來源于：Hippocampus, By Tamily Weissman, Harvard University
上期我們帶大家全面深入地了解了熒光蛋白，本期我們將和大家一起學習熒光蛋白的具體應用。
熒光蛋白的應用
如今，FPs作為標記蛋白和報告蛋白被廣泛應用于生命科學研究的諸多領域，以研究生命系統的組織和功能（圖1）。
圖1：FPs的主要應用領域
（Chudakov, D. M., et al. (2010). Physiol Rev 90(3): 1103-1163.）
①標記蛋白
作為標記蛋白，構建熒光融合蛋白(Fluorescent Fusion Protein, FFP)可以用于研究蛋白定位，追蹤其動態變化，追溯其歷史和研究蛋白之間的相互作用。那么，如何構建FFP呢？在設計FFP時，我們需要考慮多方面的因素，如FFP的預期用途，選擇哪種FP，插入位置等等。隨著FPs的發現和發展，很多熒光蛋白載體可通過商業化公司獲得。縱觀這些載體，FP通常位于多克隆位點附近（即目標蛋白的N端或C端，圖2）。在根據上述FP選擇指南選定載體后，我們僅需通過簡單的亞克隆技術將目標蛋白克隆至多克隆位點區即可。當FP位于目標蛋白C端時，為了確保兩者的正確折疊和功能，一段由2-10個氨基酸組成的鏈接序列（GS間隔，linker）往往是有用的。
圖2a：Clontech pEGFP-C1載體信息
圖2b：Clontech pEGFP-N1載體信息
但是，在許多情況下，我們需要根據目標蛋白的實際情況修飾FFP，如內質網蛋白和膜蛋白：一個典型的內質網蛋白通常含有兩段關鍵序列（信號序列，SS；內質網滯留序列，KDEL），若其功能域靠近C端，FP應置于SS下游2-10個氨基酸處，這樣可以提高SS的切割效率，并有利于FFP的內質網易位；若其功能域靠近N端，FP應插入KDEL之前；對于單次跨膜蛋白，FP不能置于跨膜結構域(TMD)內/附近，因為這將破壞結構域并導致膜整合的問題；對于多次跨膜蛋白，除了單次跨膜蛋白的不適位置外，FP也不可置于TMDs之間的環內，因為TMDs之間的精確間距對于其正確折疊非常重要，且這些環通常包含功能域（圖3）。另外，還有些目標蛋白在成熟過程中會切掉一段，如自噬標志物LC3。
圖3：FFP中FP的理想插入位置
（Chudakov, D. M., et al. (2010). Physiol Rev 90(3): 1103-1163.）
總之，不管如何構建FFP，我們均需要確保FFP的序列正確，并通過實驗確認其是否發光，其定位模式是否與目標蛋白的類似，是否保留有目標蛋白的功能等等。
②報告蛋白
作為報告蛋白，FPs借助極具市場前景的AAV病毒載體被廣泛應用于神經科學研究的各個階段，包括神經標記，基因操作，生理操縱和生理觀察。下面我們僅列舉幾個例子說明：
案例1：FPs用于標記全腦和局部腦區的神經細胞（圖4）
圖4a：較AAV9，1×10E11vg AAV-PHP.eB-tdTomato高效標記C57BL/6J小鼠的全腦神經細胞，而不標記B6C3小鼠
（Mathiesen, S. N., et al. (2020). Mol Ther Methods Clin Dev 19: 447-458.）
圖4b：1.5-2ul AAV5-hSyn-EGFP標記海馬腹側下托神經元
圖4c：2ul AAV5-hSyn-mCherry標記孤束核神經元
（圖片來源于客戶）
案例2：添加靶序列和滯留序列的FPs用于標記亞細胞結構和追蹤其動態變化（圖5）
圖5：Ach3.0質粒和帶亞細胞標記物的mScarlet共轉染神經元細胞的熒光圖片
注：Ach3.0：第二代綠色乙酰膽堿熒光探針；CAAX：細胞質膜標記物；SYP（ synaptophysin）：突觸前標記物
（Jing, M., et al. (2020). Nat Methods 17(11): 1139-1146.）
結 語
隨著技術的進步，越來越多的FPs被開發并應用。因此，科研人對于FPs可以說是眾所周知。盡管目前已有的FPs為科研人的各種成像實驗帶來了眾多選擇。但是，隨著研究的深入，科研人對于成像實驗提出了更高的需求，尤其在神經網絡縱橫交錯的神經系統中體現地淋漓盡致。未來，亮度高、穩定性高的單體FPs將可以進行更密集的成像實驗；高效折疊的單體光轉換FPs將提高我們光標記融合蛋白的能力，FPs光譜的長波長端將繼續拓寬，使科研人能夠在深組織和整個動物中進行更靈敏、更高效的成像實驗。
參考文獻
1、Chudakov, D. M., et al. (2010). "Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues." Physiol Rev 90(3): 1103-1163.
2、Mathiesen, S. N., et al. (2020). "CNS Transduction Benefits of AAV-PHP.eB over AAV9 Are Dependent on Administration Route and Mouse Strain." Mol Ther Methods Clin Dev 19: 447-458.
3、Jing, M., et al. (2020). "An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity." Nat Methods 17(11): 1139-1146.