01 研究背景
2019冠狀病毒病(COVID-19)的發(fā)病機(jī)制受活性氧(ROS)的影響，然而其具體機(jī)制尚不明確。冠狀病毒SARS-CoV-2核衣殼蛋白(S2NP)是該疾病的主要驅(qū)動(dòng)因子，也是病毒復(fù)制和組裝不可或缺的結(jié)構(gòu)蛋白，但其在ROS生成中的作用尚未報(bào)道。2023年11月，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉超紅教授團(tuán)隊(duì)在Journal of Medical Virology (IF 12.7) 上發(fā)表文章“SARS-CoV-2 nucleocapsid protein enhances the level of mitochondrial reactive oxygen species”，發(fā)現(xiàn)S2NP表現(xiàn)出顯著的線粒體定位，與線粒體轉(zhuǎn)錄成分相互作用并穩(wěn)定其蛋白水平；此外S2NP還會(huì)損害抗氧化酶的活性，表明S2NP可能通過多種機(jī)制促進(jìn)線粒體ROS的產(chǎn)生。
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基因信息
S2NP：SARS-CoV-2核衣殼蛋白
病毒產(chǎn)品
Ad5-S2NP，Ad5-NC
感染細(xì)胞
人肺癌細(xì)胞A549（MOI：100），
人支氣管上皮細(xì)胞 HBE
02結(jié)果展示
1. S2NP可提高線粒體ROS水平
為了探究S2NP是否影響線粒體ROS水平，作者利用腺病毒5型載體在A549細(xì)胞中過表達(dá)S2NP，并使用MitoSOXTM（活性氧熒光探針）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。流式細(xì)胞分析顯示，S2NP過表達(dá)組比對(duì)照組表現(xiàn)出更高水平的線粒體ROS。為了進(jìn)一步研究S2NP增強(qiáng)線粒體ROS水平的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)S2NP過表達(dá)組表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄組改變，所有線粒體編碼蛋白的mRNA水平均上調(diào)，qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。GO分析發(fā)現(xiàn) “氧化磷酸化”、“ATP合成耦合電子傳遞”、“呼吸電子傳遞鏈”等過程相關(guān)基因顯著富集。
圖1. S2NP可提高線粒體ROS水平
2. S2NP的表達(dá)增強(qiáng)了復(fù)合物I和III的活性
RNA測(cè)序表明S2NP會(huì)損害ATP合成和電子傳遞，作者檢測(cè)了S2NP對(duì)ATP生成的影響，發(fā)現(xiàn)S2NP過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)ATP水平低于對(duì)照組，表明S2NP的表達(dá)阻礙了ATP的產(chǎn)生。ATP合成過程中的電子泄漏主要發(fā)生在復(fù)合物I和III上，作者發(fā)現(xiàn)S2NP的表達(dá)導(dǎo)致復(fù)合物I活性弱增強(qiáng)，復(fù)合物III活性顯著增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果也顯示線粒體編碼的復(fù)合體I和III蛋白的mRNA水平在S2NP過表達(dá)細(xì)胞中上調(diào)，IB實(shí)驗(yàn)也證實(shí)MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND6和MT-CYB的蛋白水平在S2NP過表達(dá)細(xì)胞中增加。這些數(shù)據(jù)集表明S2NP蛋白部分增強(qiáng)了復(fù)合物I和III的活性。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明，S2NP顯示出明顯的線粒體定位。
圖2. S2NP的表達(dá)增強(qiáng)了復(fù)合物I和III的活性
3. S2NP通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)增強(qiáng)線粒體轉(zhuǎn)錄組分的穩(wěn)定性
線粒體編碼的13種蛋白質(zhì)是ATP合成和電子傳遞所必需的，其轉(zhuǎn)錄是在線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (TFAM)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2 (TFB2M)的參與下進(jìn)行。RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)POLRMT、TFB2M和TFAM的mRNA與S2NP無關(guān)，但POLRMT、TFB2M和TFAM蛋白水平在S2NP過表達(dá)細(xì)胞中明顯升高。MG132(蛋白酶體抑制劑)能導(dǎo)致A549細(xì)胞中POLRMT、TFB2M和TFAM蛋白水平升高，表明這些蛋白在動(dòng)態(tài)平衡中經(jīng)歷蛋白酶體依賴性降解。在MG132存在的情況下，S2NP過表達(dá)對(duì)POLRMT、TFB2M和TFAM蛋白水平的增強(qiáng)作用減弱，表明S2NP阻斷了蛋白酶體依賴性線粒體轉(zhuǎn)錄成分的降解。作者還發(fā)現(xiàn)S2NP表達(dá)會(huì)阻斷A549細(xì)胞中TFAM的泛素化。這些數(shù)據(jù)表明S2NP通過結(jié)合并穩(wěn)定線粒體轉(zhuǎn)錄成分來促進(jìn)線粒體編碼的復(fù)合物I和III蛋白的轉(zhuǎn)錄。
圖3. S2NP通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)增強(qiáng)線粒體轉(zhuǎn)錄組分的穩(wěn)定性
4. S2NP損害抗氧化酶的活性
有研究表明ROS水平的增加導(dǎo)致抗氧化酶的表達(dá)降低，RNA測(cè)序結(jié)果顯示， S2NP的表達(dá)導(dǎo)致SOD1、GPX1、GPX3和GPX4水平降低，GPX2水平升高。qPCR實(shí)驗(yàn)無法證實(shí)SOD1的下調(diào)，但它證實(shí)了S2NP表達(dá)后CAT和GPX8水平不變，GPX2水平升高，GPX4水平降低，IB實(shí)驗(yàn)表明S2NP過表達(dá)細(xì)胞中SOD1蛋白表達(dá)降低，CAT和GPX8蛋白水平不變。因此，SOD1數(shù)據(jù)的差異可能是PCR引物特異性較低所致。測(cè)定抗氧化酶的活性顯示，S2NP部分抑制SOD和GPX的活性，這與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明會(huì)損害抗氧化酶的活性。
圖4. S2NP損害抗氧化酶的活性
03實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)S2NP表達(dá)可提高線粒體ROS水平，增強(qiáng)線粒體轉(zhuǎn)錄組分的穩(wěn)定性；S2NP增強(qiáng)了電子傳遞復(fù)合物I和III的活性，損害抗氧化酶的活性。在機(jī)制上，S2NP表現(xiàn)出顯著的線粒體定位，與線粒體轉(zhuǎn)錄成分相互作用并使其保持穩(wěn)定，從而提高線粒體ROS水平。