Cell Reports：奧古斯塔大學(xué)蘇華波教授團(tuán)隊(duì)揭示類泛素化修飾在調(diào)節(jié)心臟成熟和代謝中的關(guān)鍵作用！
2023年1月19日，美國(guó)奧古斯塔大學(xué)蘇華波教授研究團(tuán)隊(duì)在Cell Reports (IF 8.8)發(fā)表題為“Neddylation is required for perinatal cardiac development through stimulation of metabolic maturation”的研究論文。文章提出類泛素化通過調(diào)節(jié)正常的發(fā)育代謝轉(zhuǎn)變，促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟和圍產(chǎn)期心臟發(fā)育，揭示類泛素化是調(diào)節(jié)心臟成熟和代謝的關(guān)鍵翻譯后機(jī)制。
病毒產(chǎn)品
AAV9-cTnT-Cre-WPRE
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
NAE1F/+ 和 NAE1F/F小鼠（P1）
注射方式
皮下注射
病毒用量
高劑量：5 x 10E11 GC/pup
中劑量：0.5 x 10E11 GC/pup
低劑量：0.25 x 10E11 GC/pup
研究背景
心臟成熟對(duì)出生后心臟發(fā)育至關(guān)重要，成熟過程一旦發(fā)生中斷極易導(dǎo)致先天性心臟病或成年時(shí)期心肌病和心力衰竭的發(fā)生。研究報(bào)道，心臟成熟涉及一系列轉(zhuǎn)錄因子和翻譯后修飾調(diào)控，目前調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞代謝成熟的多個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子已被揭示，例如HIF1α、ERRα和ERRγ等，然而調(diào)節(jié)心臟成熟的翻譯后機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白8 (NEDD8)是一種泛素樣蛋白，以類泛素化方式共價(jià)修飾靶蛋白。作者先前的研究證明，NEDD8類泛素化通路與心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)及心肌病相關(guān)，并在出生后心臟中表達(dá)下調(diào)，預(yù)示類泛素化修飾可能在心臟成熟中起著不可或缺的作用。
研究結(jié)果
1.NAE1在出生后心臟的缺失可引起擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭
NAE1是目前已發(fā)現(xiàn)的唯一的NEDD8活化酶，敲除NAE1可完全抑制類泛素化過程。作者將不同劑量的AAV9-cTnT-Cre病毒載體通過皮下注射至新生NAE1Flox/Flox小鼠和NAE1 Flox/+小鼠體內(nèi)，構(gòu)建了心臟特異性NAE1敲除小鼠和對(duì)照小鼠，值得注意的是，高劑量（5 x 10E11 GC/pup）病毒注射可轉(zhuǎn)導(dǎo)約80%的心肌細(xì)胞，NAE1的mRNA和蛋白水平均顯著降低，類泛素化水平得到明顯抑制。通過對(duì)這些小鼠的心臟進(jìn)行表征分析，作者發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組小鼠相比，NAE1敲除小鼠在病毒注射后六周發(fā)生了擴(kuò)張性心肌病并最終導(dǎo)致心力衰竭，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到心臟應(yīng)激標(biāo)志物Nppa和Nppb上調(diào)，Serca2a下調(diào)。表明類泛素化對(duì)出生后心臟的正常發(fā)育是不可或缺的。
圖1. NAE1在出生后心臟的缺失導(dǎo)致心力衰竭
2.NAE1缺失損害CM的成熟
作者假設(shè)NAE1的缺失可能影響了心肌細(xì)胞（CM）成熟，繼而引發(fā)NAE1敲除小鼠心肌病。對(duì)CM中的T小管進(jìn)行標(biāo)記及成像，觀察到NAE1敲除的心肌細(xì)胞中T小管發(fā)育受到嚴(yán)重影響，表現(xiàn)為排列紊亂，含量、完整性和規(guī)律性顯著降低，表明類泛素化對(duì)T小管組織至關(guān)重要。此外，低劑量AAV給藥的NAE1F/F小鼠CM大小出現(xiàn)異常，同時(shí)，中劑量AAV處理的NAE1F/F小鼠心臟中，一些參與肌節(jié)和電生理成熟的基因發(fā)生了明顯的胎兒和成人亞型表達(dá)變化，進(jìn)一步證明了類泛素化在CM成熟中的重要作用。
圖2. 抑制類泛素化會(huì)損害CM的成熟
3.NAE1缺失損害心臟氧化代謝和線粒體功能
圍產(chǎn)期會(huì)發(fā)生從糖酵解到氧化代謝的轉(zhuǎn)變，這是CM成熟和產(chǎn)后心臟發(fā)育所必需的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，與NAE1F/+小鼠心臟相比，中劑量AAV-Cre感染的NAE1F/F小鼠心臟中與脂肪酸利用有關(guān)的基因下調(diào)，而與葡萄糖利用的基因則顯著上調(diào)。此外，western印跡也證實(shí)了NAE1敲除小鼠中調(diào)節(jié)脂肪酸利用的酶和參與線粒體生物發(fā)生的蛋白質(zhì)減少。進(jìn)一步分析顯示NAE1CKO導(dǎo)致脂肪酸氧化基因acadm、Cpt1b、atgl mRNA水平顯著降低，NAE1的缺失還造成了CMs線粒體功能障礙。
作者通過體外抑制新生大鼠心室心肌細(xì)胞（NRVCs）的NAE1表達(dá)，進(jìn)一步證明抑制類泛素化可損害CMs中的脂肪酸氧化代謝，代謝組學(xué)分析結(jié)果更加表明，類泛素化顯著影響CMs中葡萄糖和脂肪酸代謝相關(guān)途徑。
圖3. NAE1缺陷小鼠心臟脂肪酸氧化代謝和線粒體功能受損
小結(jié)
本研究確定類泛素化通過調(diào)節(jié)代謝轉(zhuǎn)變，在心臟細(xì)胞成熟和出生后心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用。具體來講，類泛素化作用修飾HIF1α和Cul2，并且這兩種蛋白的類泛素化在促進(jìn)HIF1α泛素化和降解方面具有協(xié)同作用，這對(duì)心臟發(fā)育中建立氧化代謝至關(guān)重要。抑制類泛素化會(huì)導(dǎo)致HIF1α蛋白的積累和持續(xù)的HIF1α信號(hào)通路，從而抑制妊娠晚期和產(chǎn)后心臟的脂肪酸利用，導(dǎo)致CM成熟缺陷，最終導(dǎo)致心力衰竭，表明類泛素化是CM成熟和圍產(chǎn)期心臟發(fā)育所必需的。