類器官是指利用干細(xì)胞、祖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等在體外培養(yǎng)的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它們展現(xiàn)出空間結(jié)構(gòu)和類似組織的排列。2021年，類器官技術(shù)被中國“十四五”規(guī)劃確定為重點(diǎn)研發(fā)方向之一。作為疾病模型，與傳統(tǒng)的二維疾病模型相比，類器官更接近體內(nèi)環(huán)境，因此在細(xì)胞治療、藥物開發(fā)、遺傳工程、免疫學(xué)和組織再生等領(lǐng)域至關(guān)重要。
以下內(nèi)容將指導(dǎo)您完成培養(yǎng)小鼠腸道類器官的整個(gè)過程，并強(qiáng)調(diào)相關(guān)注意事項(xiàng)，以盡量減少培養(yǎng)過程中的陷阱。
實(shí)驗(yàn)材料
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Product Type |
Product Name |
Catalog Number |
Specifications |
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Intestinal Tissue Digestion |
C231131 |
30ml |
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Organoid Culturing Support |
Arcegel Matrix for Organoid culture, Phenol Red-Free, LDEV-Free |
C231009 |
5 mL |
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Culture Medium Components and Additives |
C231114 |
500ml |
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C230135 |
500ml |
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Recombinant Human RSPO1 Protein |
C230254 |
100ug |
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Recombinant Human Noggin Protein, His Tag |
C230462 |
100ug |
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Recombinant Human EGF Protein |
C230328 |
100ug |
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Recombinant Human Wnt -3a Protein |
C230259 |
100ug |
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Organoid Collection |
Cell recovery solution for Organoid |
C231103 |
30mL |
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Organoid Cryopreservation |
C231104 |
30mL |
小腸類器官培養(yǎng)方法
1、樣本準(zhǔn)備
通過頸椎脫位的方式對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，并用酒精對(duì)表面進(jìn)行消毒。
在無菌條件下，從距離胃部3到15厘米的小腸中提取腸道組織，使用鑷子仔細(xì)去除腸系膜和脂肪，將其放入含有1%抗生素/抗真菌劑的DPBS溶液中，并置于4°C下保存。
2、樣本清洗
使用注射器將腸道沖洗2-3次，然后仔細(xì)用手術(shù)剪刀剪開腸管，將腔面朝上放置。
使用手術(shù)刀片輕輕刮除腔面上的絨毛，直到組織變得透明。在含有DPBS的新培養(yǎng)皿中清洗腸道組織2-3次。
3、樣本初步處理
將清洗干凈的小腸組織切成2毫米寬的小塊，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50毫升離心管中。
用DPBS輕輕沖洗組織3-5次，以去除絨毛細(xì)胞和浮動(dòng)的脂肪組織。
4、組織消化
向清洗干凈的小腸組織塊中加入10-15mL預(yù)冷的含有3-5mM EDTA的DPBS溶液，并在4°C下消化約30分鐘，每10分鐘輕輕搖動(dòng)試管。
消化后，倒掉EDTA溶液，并用新鮮的DPBS輕輕沖洗組織2-3次，以去除殘留的EDTA。
向小腸組織塊中加入10-15mL預(yù)冷的含有0.1% BSA的DPBS溶液，反復(fù)用移液管抽吸和懸浮組織碎片，以分離隱窩細(xì)胞。
當(dāng)觀察到大量類似隱窩的結(jié)構(gòu)時(shí)停止抽吸，然后通過70μm濾網(wǎng)過濾組織懸液，并收集通過濾網(wǎng)的組織懸液。
5、混合物制備
將隱窩沉淀重新懸浮在Arcegel基質(zhì)凝膠中，每10μL基質(zhì)凝膠懸液中含有200-600個(gè)隱窩。
將混合懸液置于冰上，并迅速進(jìn)行下一步操作，以避免基質(zhì)凝膠凝固。
將基質(zhì)凝膠懸液稀釋至≥50%的稀釋比例，以確保Arcegel基質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性。
將混合懸液種植在24孔板底部中心，每個(gè)孔約30-50μL，避免接觸板壁。
6、培養(yǎng)
將板放置在37°C CO2培養(yǎng)箱中約30分鐘，直到Arcegel基質(zhì)凝膠完全固化。
Arcegel基質(zhì)凝膠完全固化后，沿著孔壁緩慢加入預(yù)先準(zhǔn)備的小腸類器官培養(yǎng)基，每個(gè)孔約800μL。
將24孔板放置在37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，并監(jiān)測(cè)類器官的生長情況。通常，小鼠小腸類器官在5-7天內(nèi)形成。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Figure Ex vivo culture results of mouse small intestinal organoids.
小腸類器官傳代
在培養(yǎng)5-7天或當(dāng)小腸類器官中心變黑時(shí)，可以進(jìn)行傳代。預(yù)先在培養(yǎng)箱中預(yù)熱24孔或12孔板至少30分鐘。移除舊培養(yǎng)基，每個(gè)孔加入1mL冷DPBS，等待1分鐘，輕輕提起Arcegel，用1毫升移液管尖端抽吸分散，用注射器吸取懸液，重復(fù)此步驟一次，將懸液轉(zhuǎn)移到5mL離心管中，以1200轉(zhuǎn)每分鐘，4°C下離心5分鐘，倒掉上清液，并按每個(gè)孔1:3的比例傳代。
小腸類器官的冷凍保存
選擇生長旺盛的類器官（通常在傳代后3-4天）進(jìn)行冷凍保存，每個(gè)冷凍管取兩個(gè)孔的量。移除培養(yǎng)基，加入1mL細(xì)胞冷凍介質(zhì)，用移液管尖端分散Arcegel，將懸液轉(zhuǎn)移到冷凍管中，將冷凍管放入冷凍盒中，在-80°C下冷凍1天，然后轉(zhuǎn)移到液氮中長期保存。
小腸類器官的復(fù)蘇
預(yù)先在培養(yǎng)箱中預(yù)熱24孔板30分鐘。從液氮中取出冷凍管，放入37°C水浴中。一旦冷凍管內(nèi)容物解凍，用1mL注射器吸取，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，以1200轉(zhuǎn)每分鐘，4°C下離心5分鐘，倒掉上清液，加入5mL冰冷的DPBS重新懸浮，重復(fù)離心步驟，倒掉上清液。按照標(biāo)準(zhǔn)類器官培養(yǎng)方法進(jìn)行類器官培養(yǎng)。
常見問題
組織消化時(shí)應(yīng)選擇哪種消化液，以及消化時(shí)間是多長？
對(duì)于組織的消化，可以選擇EDTA或膠原酶。如果消化中空器官，EDTA是合適的，如小腸和胃。膠原酶有多種類型，可以用于多種組織類型，通常與DNase聯(lián)合使用。消化時(shí)間根據(jù)組織類型而有很大差異，從幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)不等，根據(jù)具體產(chǎn)品的說明書進(jìn)行操作。
培養(yǎng)不同孔板的類器官需要多少體積的基質(zhì)凝膠和培養(yǎng)基？
培養(yǎng)類器官常用的孔板是24孔板，每個(gè)孔加入50μL的基質(zhì)凝膠形成滴液，然后加入500μL的培養(yǎng)基覆蓋滴液。對(duì)于96孔板，每個(gè)孔加入10μL的基質(zhì)凝膠形成滴液，然后加入200μL的培養(yǎng)基覆蓋滴液。在6孔板中，每個(gè)孔可以種植多個(gè)50μL的滴液，并加入2-3mL的培養(yǎng)基覆蓋滴液。