在免疫效應(yīng)功能研究和藥物誘導(dǎo)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)等廣泛的體外應(yīng)用中，細(xì)胞死亡定量檢測(cè)是核心環(huán)節(jié)。乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）釋放試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、可規(guī)模化，被廣泛用于評(píng)估細(xì)胞膜完整性損傷。本文綜述了LDH檢測(cè)法的基本原理與固有局限性，并重點(diǎn)闡述如何通過(guò)優(yōu)化顯色讀數(shù)系統(tǒng)來(lái)提升檢測(cè)的可靠性。
1 LDH釋放：細(xì)胞毒性標(biāo)志物
1.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)方法概述
細(xì)胞毒性（Cytotoxicity）涵蓋了細(xì)胞對(duì)損傷性刺激產(chǎn)生的一系列反應(yīng)譜，從細(xì)胞功能的短暫改變到不可逆的膜損傷及細(xì)胞死亡。歷史上，研究者開發(fā)了多種方法來(lái)定量檢測(cè)體外細(xì)胞死亡：
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鉻51（Chromium，Cr51）釋放試驗(yàn)：雖然具有高靈敏度，但涉及電離輻射危害和法規(guī)限制1
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熒光標(biāo)記法（如膜不通透性DNA染料（如碘化丙啶，Propidium Iodide）、胺反應(yīng)性活性染料）：可實(shí)現(xiàn)敏感的單細(xì)胞分析，但需要專門的儀器和多步驟流程，限制了其可擴(kuò)展性2
這些限制促使比色法LDH釋放試驗(yàn)成為常規(guī)細(xì)胞毒性評(píng)估的實(shí)用替代方案1,2。
1.2 膜損傷后的LDH釋放
LDH是一種穩(wěn)定的胞質(zhì)酶，參與乳酸代謝循環(huán)。細(xì)胞膜破裂后，LDH迅速釋放至細(xì)胞外環(huán)境，其活性可用于評(píng)估多種細(xì)胞死亡方式，包括壞死（Necrosis）、壞死性凋亡（Necroptosis）和焦亡（Pyroptosis）。在細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、鐵死亡（Ferroptosis）或氧化性細(xì)胞死亡（Oxidative Cell Death）的晚期階段，一旦質(zhì)膜被破壞，也可檢測(cè)到LDH釋放。因此，LDH活性檢測(cè)主要反映的是細(xì)胞膜完整性的喪失，而非細(xì)胞死亡的具體機(jī)制。
1.3 比色法LDH檢測(cè)原理
LDH活性通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定：LDH將乳酸氧化為丙酮酸，同時(shí)將NAD+還原為NADH。隨后，NADH在催化劑（如黃遞酶（Diaphorase）或吩嗪類電子介體）的作用下驅(qū)動(dòng)四唑鹽還原，生成有色（傳統(tǒng)為紅色）的甲臜（Formazan）產(chǎn)物，可通過(guò)分光光度法定量1-4。甲臜信號(hào)與細(xì)胞外LDH活性成正比，可提供定量且線性的細(xì)胞膜破壞程度指標(biāo)。
圖1：比色法LDH釋放測(cè)定原理。
圖示為受損細(xì)胞釋放LDH的過(guò)程，以及使用基于甲臢的比色法進(jìn)行定量分析。底部圖示為孔內(nèi)培養(yǎng)基顏色的變化，使用LDH-Blue™ Plus（InvivoGen）時(shí)，培養(yǎng)基顏色由淺橙色變?yōu)樗{(lán)紫色；而使用傳統(tǒng)檢測(cè)方法（競(jìng)品）時(shí)，培養(yǎng)基顏色則變?yōu)槌燃t色，二者顏色變化與LDH活性成正比。
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1.4 傳統(tǒng)LDH檢測(cè)法的局限性
盡管基于紅色甲臜的傳統(tǒng)LDH檢測(cè)法應(yīng)用廣泛，但仍存在一些可能影響數(shù)據(jù)解讀的局限性3：
? 與培養(yǎng)基中的酚紅（Phenol Red）光譜重疊，導(dǎo)致背景信號(hào)升高
? 自發(fā)釋放LDH產(chǎn)生的高基線信號(hào)，可能掩蓋低水平細(xì)胞毒性
? 由于背景信號(hào)和基線信號(hào)均較高，動(dòng)態(tài)范圍受限
? 在高密度培養(yǎng)條件下，檢測(cè)線性下降
這些問(wèn)題共同凸顯了改進(jìn)LDH檢測(cè)設(shè)計(jì)以增強(qiáng)信號(hào)分辨能力的必要性。
2 LDH-Blue™ Plus：克服關(guān)鍵限制
2.1 改進(jìn)比色讀數(shù)
克服上述局限的一種有效途徑在于重新設(shè)計(jì)顯色輸出系統(tǒng)。將反應(yīng)產(chǎn)物從紅色甲臜轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色甲臜，通過(guò)這一光譜轉(zhuǎn)移，可以使信號(hào)生成與培養(yǎng)基中酚紅產(chǎn)生的背景吸光度解耦。研究人員通過(guò)細(xì)胞裂解試驗(yàn)，直觀比較藍(lán)色（LDH-Blue™ Plus, InvivoGen）與紅色（競(jìng)品）甲臜的顯色效果，評(píng)估光譜偏移對(duì)肉眼觀察的影響。
圖2：使用藍(lán)色甲臜肉眼清晰檢測(cè)LDH活性。
將THP1-Null2細(xì)胞以遞減的密度接種于含酚紅的RPMI培養(yǎng)基（含裂解緩沖液）中培養(yǎng)30分鐘。使用LDH-Blue™ Plus（InvivoGen）或兩款競(jìng)品的LDH檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)上清液中的LDH活性。反應(yīng)在LDH檢測(cè)試劑加入孔板后立即開始，并隨時(shí)間推移而進(jìn)行。
傳統(tǒng)紅色甲臜信號(hào)在視覺(jué)上容易與培養(yǎng)基顏色混雜。與紅色甲臜不同，藍(lán)色甲臜信號(hào)便于肉眼監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程和最佳終止時(shí)間。這種明顯的藍(lán)紫色變化提高了實(shí)驗(yàn)的易用性，并降低了信號(hào)飽和的風(fēng)險(xiǎn)。
2.2 擴(kuò)大檢測(cè)范圍
我們?cè)u(píng)估了光譜偏移對(duì)LDH釋放檢測(cè)范圍（即最大與最小吸光度信號(hào)之差）的影響。最大吸光度信號(hào)通過(guò)完全細(xì)胞裂解獲得；最小吸光度信號(hào)包括背景吸光度（來(lái)自酚紅和添加到培養(yǎng)基中的血清中的LDH的信號(hào)）和基線吸光度（測(cè)試細(xì)胞自發(fā)釋放的LDH）。
結(jié)果顯示，在含酚紅的RPMI培養(yǎng)基中，傳統(tǒng)的LDH檢測(cè)范圍受限，因?yàn)樗鼈儠?huì)檢測(cè)到來(lái)自酚紅的背景信號(hào)。相比之下，LDH-Blue™ Plus避免了來(lái)自酚紅的背景信號(hào)干擾，從而能夠更清晰地區(qū)分低水平和高水平的細(xì)胞毒性。
圖3：使用紅色或藍(lán)色甲臜讀數(shù)的細(xì)胞毒性檢測(cè)范圍。
將THP1-Null2細(xì)胞（2x10?）在含酚紅的RPMI培養(yǎng)基（添加/不添加裂解緩沖液）中培養(yǎng)30分鐘。使用LDH-Blue™ Plus（InvivoGen，650nm波長(zhǎng)吸光度）或兩款競(jìng)品的LDH檢測(cè)試劑盒（490nm波長(zhǎng)吸光度）定量LDH活性。檢測(cè)范圍以未處理細(xì)胞與完全裂解細(xì)胞的LDH活性信號(hào)比值計(jì)算。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。
這些數(shù)據(jù)表明，使用藍(lán)色甲臜可提高檢測(cè)靈敏度，這對(duì)早期藥物篩選或低細(xì)胞毒性監(jiān)測(cè)等應(yīng)用至關(guān)重要。此外，無(wú)需為檢測(cè)調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)條件。
2.3 確保線性關(guān)系
準(zhǔn)確的細(xì)胞毒性定量依賴于甲臜生成量與細(xì)胞膜破壞程度成正比這一前提。為了評(píng)估這種關(guān)系，我們分析了多種細(xì)胞類型（包括貼壁和懸浮細(xì)胞）中LDH信號(hào)與細(xì)胞密度的相關(guān)性。
圖4：裂解細(xì)胞數(shù)量與釋放的LDH活性之間的關(guān)系。
將不同數(shù)量的(A)THP-1人單核細(xì)胞、(B)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞、(C)A549人肺癌細(xì)胞或(D)人外周血單核細(xì)胞（PBMCs）在裂解緩沖液中培養(yǎng)30分鐘。使用InvivoGen的LDH-Blue™ Plus（650nm波長(zhǎng)吸光度）或兩種競(jìng)品LDH檢測(cè)試劑盒（490nm波長(zhǎng)吸光度）定量上清液中的LDH活性。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。每種LDH檢測(cè)試劑盒的線性回歸R²值見(jiàn)圖。
傳統(tǒng)的LDH檢測(cè)在較高信號(hào)強(qiáng)度時(shí)，表現(xiàn)出偏離線性的趨勢(shì)，可能源于背景和基線吸光度的增加所致。相比之下，LDH-Blue™ Plus在細(xì)胞密度和LDH活性之間保持了良好的線性相關(guān)性（R²>0.97）。
通過(guò)最小化背景干擾并保持信號(hào)比例性，藍(lán)色甲臜讀數(shù)能夠在各種實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)現(xiàn)一致且可靠的定量分析。這減少了在檢測(cè)前對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行嚴(yán)格優(yōu)化的必要性。
2.4 提高檢測(cè)精度
焦亡是炎癥小體激活的主要結(jié)果，通常通過(guò)定量檢測(cè)LDH釋放來(lái)評(píng)估。我們?cè)贜LRP3炎癥小體激活模型中比較了LDH-Blue™ Plus與競(jìng)品的檢測(cè)效果。
使用THP-1人單核細(xì)胞（炎癥小體研究的經(jīng)典細(xì)胞模型）在96孔板以2×10?細(xì)胞/孔的密度接種。用NLRP3激活劑尼日利亞菌素（nigericin）處理細(xì)胞。當(dāng)使用藍(lán)色或傳統(tǒng)紅色甲臜檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，兩種檢測(cè)方法均顯示在上清液中LDH呈劑量依賴性釋放。
然而，傳統(tǒng)紅色檢測(cè)方法報(bào)告的LDH活性系統(tǒng)性地高于LDH-Blue™ Plus。更重要的是，在這種細(xì)胞密度下，傳統(tǒng)紅色檢測(cè)方法的信號(hào)不再呈線性關(guān)系。
圖5：使用紅色或藍(lán)色甲臜讀數(shù)對(duì)細(xì)胞焦亡進(jìn)行定量檢測(cè)。
將THP1-Null2（2x10?）用1μg/ml LPS-EK預(yù)處理3小時(shí)，然后用遞增濃度的尼日利亞菌素孵育以誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。6小時(shí)后，使用InvivoGen的LDH-Blue™ Plus或兩種競(jìng)品LDH檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)釋放的LDH活性。結(jié)果以細(xì)胞裂解后的最大LDH釋放量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（平均值±SEM）。
傳統(tǒng)紅色檢測(cè)方法在超出線性范圍時(shí)，焦亡測(cè)量的準(zhǔn)確性受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的高估。這種偏差會(huì)干擾數(shù)據(jù)的正確解讀，尤其是在評(píng)估藥物化合物毒性時(shí)。
因此，我們檢測(cè)了基于藍(lán)色和傳統(tǒng)紅色甲臜的LDH釋放檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，并將其與使用胺反應(yīng)染料測(cè)量細(xì)胞膜完整性的流式細(xì)胞術(shù)參考方法（Live/Dead®檢測(cè)）進(jìn)行了比較。
圖6：細(xì)胞死亡定量準(zhǔn)確性的比較。
將THP1-Null2（2x10?）與0.3μM星形孢菌素共同培養(yǎng)24小時(shí)以誘導(dǎo)晚期凋亡。與裂解緩沖液共同培養(yǎng)30分鐘作為陽(yáng)性對(duì)照。使用Live/Dead® assay流式細(xì)胞術(shù)試劑盒（Invitrogen, #L34966、InvivoGen的LDH-Blue™ Plus或兩種競(jìng)品LDH檢測(cè)試劑盒測(cè)定釋放的LDH活性來(lái)定量細(xì)胞死亡。結(jié)果以相對(duì)于Live/Dead®檢測(cè)結(jié)果的細(xì)胞死亡百分比表示（平均值±SEM）。相對(duì)于Live/Dead®檢測(cè)結(jié)果，細(xì)胞死亡高估的程度以紅色標(biāo)出。
在細(xì)胞毒性后期（星形孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡）中，傳統(tǒng)LDH釋放檢測(cè)方法報(bào)告的表觀細(xì)胞毒性高于流式（分別為+21%和+41%），而LDH-Blue™ Plus檢測(cè)方法與流式的結(jié)果非常接近（+1%）。
總體而言，這些研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)LDH檢測(cè)中升高的背景和基線吸光度會(huì)引入系統(tǒng)誤差，從而夸大表觀細(xì)胞毒性，尤其是在膜損傷有限或發(fā)生在早期階段的情況下。LDH-Blue™ Plus可最大限度地減少高估，并提供與參考檢測(cè)方法一致的細(xì)胞毒性測(cè)量結(jié)果。
2.5 支持可重復(fù)性
試劑穩(wěn)定性是決定實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性的關(guān)鍵因素。
☆ LDH-Blue™ Plus在4°C儲(chǔ)存一個(gè)月后，仍能保持穩(wěn)定的信號(hào)強(qiáng)度和動(dòng)態(tài)范圍，同時(shí)維持線性關(guān)系。
☆ 相比之下，傳統(tǒng)LDH檢測(cè)方法在儲(chǔ)存后會(huì)出現(xiàn)信號(hào)強(qiáng)度降低、動(dòng)態(tài)范圍縮小，表明試劑性能下降。
圖7：試劑在4°C儲(chǔ)存后的性能穩(wěn)定性。
使用遞增數(shù)量的裂解THP1-Null2細(xì)胞生成LDH釋放信號(hào)，分別使用(A)InvivoGen的LDH-Blue™ Plus（650nm吸光度）或(B,C)兩種競(jìng)品LDH檢測(cè)試劑盒（490nm吸光度）進(jìn)行測(cè)量。檢測(cè)使用現(xiàn)配的試劑混合物或在4°C下儲(chǔ)存1個(gè)月的試劑混合物進(jìn)行（平均值±SEM）。
LDH-Blue™ Plus在4°C儲(chǔ)存期間確保信號(hào)穩(wěn)定，避免實(shí)驗(yàn)間差異，支持常規(guī)工作流程中的可靠定量。
3 結(jié)論
LDH 釋放試驗(yàn)是細(xì)胞毒性定量的常用工具，但依賴紅色甲臜的傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在一些局限性，會(huì)影響測(cè)量的可靠性，需要大量的優(yōu)化。
LDH-Blue™ Plus基于藍(lán)色甲臜的比色讀數(shù)系統(tǒng)，從紅色到藍(lán)色的轉(zhuǎn)變改善了信號(hào)分辨能力，減少培養(yǎng)基中酚紅的背景干擾，從而實(shí)現(xiàn)了：
? 靈敏度：更大的檢測(cè)范圍
? 準(zhǔn)確度：更高的信號(hào)線性度
?一致性：更穩(wěn)定的線性度，便于跨實(shí)驗(yàn)和跨實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的精確比較
此外，LDH-Blue™ Plus還為常規(guī)工作流程提供多項(xiàng)實(shí)用優(yōu)勢(shì)：
? 清晰的肉眼觀察反應(yīng)監(jiān)測(cè)和最佳終止時(shí)間
? 與標(biāo)準(zhǔn)含酚紅培養(yǎng)基的兼容性以及在各種細(xì)胞密度下均能進(jìn)行穩(wěn)健的定量分析，從而減少了優(yōu)化需求
? 此外，該試劑盒經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)，可在4°C儲(chǔ)存時(shí)提高試劑穩(wěn)定性。
綜上所述，這些特性使LDH-Blue™ Plus成為研究和篩選應(yīng)用中準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞毒性的可靠且易于使用的解決方案。
*本文為 InvivoGen 原創(chuàng)，版權(quán)歸 InvivoGen 所有。
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研究工具
InvivoGen的LDH-Blue™ Plus是一款全新且更穩(wěn)定的創(chuàng)新型比色法檢測(cè)試劑盒，用于測(cè)定受損或裂解細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH活性。該試劑盒采用可生成藍(lán)色甲臜產(chǎn)物的底物，使培養(yǎng)基顏色由淡紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。
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