一、實(shí)驗(yàn)材料

Arcegen標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)膠(Cat#C231001）、DMEM、PBS緩沖液、去離子水、4%多聚甲醛、0.1%結(jié)晶紫染色液、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell小室（8μm）、超凈工作臺(tái)

二、實(shí)驗(yàn)步驟

第1天上午 ，Transwell 小室鋪膠

1）1:8 稀釋基質(zhì)膠：100μL基質(zhì)膠加入800μL無(wú)血清培養(yǎng)基，吹打混勻后，彈動(dòng) EP管使液體集中在管底（稀釋后的基質(zhì)膠濃度參考1mg/mL，不超過(guò)3mg/mL； 稀釋比例并不固定，也可以取中間值1:4）。

2）混勻后立即吸取50μL稀釋后的基質(zhì)膠到Transwell 小室上層，逐滴加入，液面厚度3mm，蓋上蓋子震板3-5次，使得每個(gè)小室上層液面平齊。

3）置于37℃培養(yǎng)箱中2-4h充分凝固。

4）使用前需進(jìn)行水化，加入200μL無(wú)血清培養(yǎng)基水化30min（潤(rùn)透即可，時(shí)間可延長(zhǎng)）。

第1天下午，制備 Hela 細(xì)胞懸液以及細(xì)胞接種

1）提前一天更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞饑餓12-24h，目的是為了去除血清的影響。

2）使用胰酶消化Hela細(xì)胞，終止消化后離心棄掉培養(yǎng)液，使用PBS清洗1-2次，使用含BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸調(diào)整Hela 細(xì)胞密度為5×10⁴-5×10⁵個(gè)/mL。

3）取100-200μL Hela細(xì)胞懸液加入Transwell小室上層。

4）在24孔板的下室加入600μL含20% FBS 的培養(yǎng)基。

注：添加時(shí)需避免下室中的培養(yǎng)液和小室間產(chǎn)生氣泡，如有氣泡會(huì)影響下層培養(yǎng)液的趨化作用，使其減弱甚至消失。

5） 于 37℃ 5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-48h（培養(yǎng)時(shí)間依據(jù)癌細(xì)胞的侵襲能力而定）。

第3天上午，染色及統(tǒng)計(jì)

1）取出 Transwell 小室棄去孔中培養(yǎng)液，使用棉簽輕輕擦拭上層未遷移的細(xì)胞。使用不含鈣鎂離子的 PBS 緩沖液清洗2次。

2）使用4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞固定30min，或使用75%乙醇固定10min。

3）棄掉固定液，PBS清洗3次，加入適量0.1%結(jié)晶紫染色液室溫染色30min。

4）染色完成后使用去離子水進(jìn)行清洗，直至清洗液無(wú)明顯紫色。于200×和 400×顯微鏡下觀察并拍照統(tǒng)計(jì)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng) 48h 后 Hela 細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果，遷移到 PET 膜下層的 Hela 細(xì)胞數(shù)量較多。

200×

400×

四、產(chǎn)品推薦