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胰腺癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，常被稱為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的“癌中之王”。根據(jù)《柳葉刀》的數(shù)據(jù)，胰腺癌的五年生存率大約為10%，使其成為預(yù)后最差的癌癥之一。胰腺癌的臨床癥狀通常不明顯且不典型，這使得這種消化系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷和治療都面臨挑戰(zhàn)。因此，適合研究胰腺癌生理特征和治療選擇的類器官模型作為疾病模型和再生醫(yī)學(xué)在胰腺研究領(lǐng)域中至關(guān)重要，越來越受到研究者的關(guān)注和使用。

胰腺類器官的現(xiàn)狀

目前，類器官培養(yǎng)技術(shù)在胃、腸、肝臟、膽管和大腦等多個(gè)器官中取得了顯著進(jìn)展。胰腺是人體中唯一同時(shí)作為外分泌腺和內(nèi)分泌腺的器官，這對(duì)胰腺類器官技術(shù)的發(fā)展構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。

胰腺分為外分泌部分和內(nèi)分泌部分。外分泌腺由腺泡和導(dǎo)管組成，而內(nèi)分泌腺由朗格漢斯島組成。外分泌腺是胰腺炎和胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）的起源。我們對(duì)包括PDAC在內(nèi)的人類胰腺疾病的起源和發(fā)展的理解是有限的。盡管胰腺導(dǎo)管和胰島類器官的技術(shù)正在改進(jìn)，但在體外維持腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，構(gòu)建復(fù)雜的胰腺類器官仍然是當(dāng)前研究的瓶頸。

胰腺類器官可以從健康的胰腺或胰腺腫瘤中獲得，并作為體外和體內(nèi)模型之間的重要轉(zhuǎn)化橋梁。已有報(bào)道稱從人類多能干細(xì)胞誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管和腺泡類器官，這些類器官表現(xiàn)出新生兒外分泌胰腺的特征。我們已經(jīng)開發(fā)了一種可再生的導(dǎo)管和腺泡類器官來源，用于模擬外分泌發(fā)育和疾病。具體的協(xié)議和程序如下：

培養(yǎng)方法

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

研究團(tuán)隊(duì)從Hues-8細(xì)胞中提取了胰腺前體（PP）細(xì)胞，在S1+4天誘導(dǎo)階段收集，并使用TrypLE將其分散成單細(xì)胞。消化后的細(xì)胞以1500轉(zhuǎn)每分鐘的速度離心5分鐘，然后重新懸浮在含有5% 基質(zhì)膠的分化培養(yǎng)基中，最終細(xì)胞密度為50,000細(xì)胞/毫升。將細(xì)胞懸浮液接種到預(yù)先涂有100% Matrigel的培養(yǎng)板上，每四天更換一次培養(yǎng)基，并補(bǔ)充5%基質(zhì)膠。

2. 胰腺導(dǎo)管誘導(dǎo)

對(duì)于導(dǎo)管細(xì)胞的誘導(dǎo)，分化（堿性）培養(yǎng)基由DMEM、1%青霉素-鏈霉素、1% B-27、10 ng/mL FGF-1、50 μg/mL抗壞血酸、1 μM A 83-01、10 ng/mL FGF-10和1 ng/mL EGF組成。

第一階段（第0-4天）：導(dǎo)管誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基，并補(bǔ)充了10 μM Y-27632、50 nM SB939、3 μM IWP-2、25 nM IQ-1、50 nM iCRT14、15 ng FGF-10、10 ng/mL FGF-2和5 ng/mL EGF。

第二階段（第4-8天）：導(dǎo)管誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基，并補(bǔ)充了3 μM IWP-2、25 nM IQ-1、50 nM iCRT14和5 μM Y-27632。

第三階段（第8-12天）：導(dǎo)管誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基，并補(bǔ)充了3 μM IWP-2、25 nM IQ-1、50 nM iCRT14和0.1 μM XAV-939。

第四階段（第12天）：導(dǎo)管誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基，并補(bǔ)充了3 μM IWP-2、5 nM IQ-1和10 nM iCRT14。

Figure 1.A. Schematic of Ductal-like and Acinar-like Organoid Induction Protocols.B. Phase-Contrast Images of Organoids at Day 16 of Culture (n = 3, independent cultures), Scale bar, 50 millimeters.

Figure 2. RNA Expression of Pancreatic Ductal Markers SOX9 (A), HNF1B (B), CAII (C), and CFTR (D) in DU and AC Cultures after 16 Days of Culture.

Figure 3. Immunofluorescence Detection of SOX9 (E) and CAII (F) Expression.

3. 胰腺腺泡誘導(dǎo)

對(duì)于腺泡細(xì)胞的誘導(dǎo)，堿性培養(yǎng)基包含DMEM、1%青霉素-鏈霉素、1% B-27、10 ng/mL FGF-1、50 μg/mL抗壞血酸、1 μM A 83-01和10 ng/mL WNT1。

I期腺泡（第0-4天）培養(yǎng)基由堿性培養(yǎng)基補(bǔ)充10 μM Y-27632、3 μM SKL 2001、50 nM地塞米松、0.3 μM CHIR-99021、50 nM XMU-MP-1、15 ng/mL WNT1、5 ng/mL FGF-2、1 ng/mL EGF和5 ng/mL FGF-10組成。

II期（第4-8天）腺泡培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基，并補(bǔ)充了3 μM SKL 2001、200 nM地塞米松、0.1 μM LDN193189和50 nM XMU-MP-1。

III期（第8-12天）腺泡培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基，并補(bǔ)充了3 μM SKL 2001、200 nM地塞米松、0.1 μM LDN193189和1 μM DBZ。

IV期（第12天）腺泡培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基，并補(bǔ)充了0.3 μM SKL 2001、25 nM地塞米松和0.1 μM DBZ。

對(duì)于涉及TGF-β處理的實(shí)驗(yàn)，從第83天起從培養(yǎng)基中去除A 83-01。

  Figure 4. RNA expression of pancreatic acinar markers PTF1A (G), RBPJL (H), and CPA1 (I) in DUs and acinar cultures after 16 days of cultivation.

Figure 5. Immunofluorescence detection of PTF1A (J) and CPA1 (K) expression in organoids.

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