小鼠小腸類器官作為一種體外模型，廣泛應(yīng)用于腸道疾病研究、藥物篩選等領(lǐng)域。類器官構(gòu)建細(xì)胞來(lái)源通常有原代細(xì)胞和干細(xì)胞兩種，由于小鼠腸道原代細(xì)胞來(lái)源廣泛、能夠更好地模擬體內(nèi)真實(shí)情況、培養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠滿足大多數(shù)研究和應(yīng)用需求，因此，小鼠小腸類器官通常使用組織分離出的原代細(xì)胞構(gòu)建。今天我們就來(lái)看看如何利用原代細(xì)胞構(gòu)建小鼠小腸類器官。
材料準(zhǔn)備
♦ 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的小鼠品系。
♦ 實(shí)驗(yàn)試劑：小鼠小腸類器官用培養(yǎng)基（可自行配制，也可直接購(gòu)買），基質(zhì)膠，DPBS，組織消化液等。
♦ 實(shí)驗(yàn)耗材：無(wú)菌操作所需的培養(yǎng)皿、離心管、移液槍頭、24孔板等，以及用于細(xì)胞過(guò)濾的70μm細(xì)胞濾網(wǎng)。
實(shí)驗(yàn)步驟
♦ 小腸組織取材
1. 小鼠處死后，表面噴灑酒精殺菌。在無(wú)菌環(huán)境下截取出近胃端處3-15cm腸組織，用鑷子小心去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含1%雙抗的DPBS溶液中。
2. 使用注射器沖洗腸道2-3次，用手術(shù)剪將腸管小心剪開(kāi)，腸腔面朝上，用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后（呈現(xiàn)透明），將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗2-3次。
♦ 隱窩分離
1. 將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬大小，轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中，用DPBS小心清洗3-5次，除去腸絨毛細(xì)胞和漂浮脂肪組織。
2. 在清洗好的小腸碎片組織加入10-15ml含有3-5mM EDTA的預(yù)冷DPBS中消化，4℃孵育30min左右，其間每10min輕搖一次離心管。
3. 消化完成后，棄去EDTA消化液上清，用新的DPBS緩沖液將組織輕柔漂洗2-3次以去除剩余EDTA。
4. 在小腸組織碎片中加入10-15ml預(yù)冷的含0.1%BSA的DPBS，反復(fù)吹打、重懸，使隱窩與基底層分離，然后取少許懸液鏡檢，當(dāng)看有大量隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對(duì)吹打后的組織懸液使用70μm濾網(wǎng)過(guò)濾并收集穿過(guò)濾網(wǎng)的組織懸液。
5. 收集得到的組織懸液，1500rpm、4℃離心3min。
♦ 基質(zhì)膠包埋與培養(yǎng)
1. 用基質(zhì)膠重懸隱窩組織沉淀，使每10μL基質(zhì)膠懸液包含200-600個(gè)隱窩，重懸后混合液置于冰上，盡快操作以避免基質(zhì)膠凝固。
2. 將混合懸液種植于24孔板底部正中央，每孔30-50μL左右，不接觸孔板側(cè)壁。
3. 將種植后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固。
4. 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入小鼠腸類器官培養(yǎng)基，每孔800μL/孔。
5. 將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基并監(jiān)測(cè)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)（一般小鼠小腸類器官在5-7天內(nèi)形成）。
小鼠小腸類器官不同天數(shù)生長(zhǎng)情況
注意事項(xiàng)
♦ 無(wú)菌操作：整個(gè)構(gòu)建過(guò)程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免污染。
♦ 溫度控制：基質(zhì)膠操作需在冰上進(jìn)行，避免其提前凝固；培養(yǎng)基在使用前需恢復(fù)至室溫。
♦ 操作輕柔：在分離隱窩和處理基質(zhì)膠時(shí)，動(dòng)作要輕柔，避免產(chǎn)生氣泡或破壞隱窩結(jié)構(gòu)。
希望以上內(nèi)容能夠幫助你順利構(gòu)建小鼠小腸類器官，有問(wèn)題歡迎大家留言討論哦。
Arcegen，全球領(lǐng)先的綜合生命科學(xué)產(chǎn)品供應(yīng)商，產(chǎn)品范圍包括細(xì)胞、蛋白質(zhì)、抗原、抗體等在內(nèi)的多種產(chǎn)品。其中，類器官技術(shù)平臺(tái)自研產(chǎn)品涵蓋基質(zhì)膠、培養(yǎng)基、無(wú)血清添加劑、細(xì)胞因子等，高活性、低內(nèi)毒、批間一致性高，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)流程，致力于簡(jiǎn)化、標(biāo)準(zhǔn)化類器官培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)類器官培養(yǎng)最優(yōu)解。
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