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糖尿病(DM)是一種慢性代謝性疾病，其特征在于由多種疾病因素導(dǎo)致的血糖水平升高。它與家族遺傳、環(huán)境因素和自身免疫有關(guān)，由于其對人類健康的嚴重影響，引起了重大的公共衛(wèi)生問題。糖尿病的并發(fā)癥不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，也是致殘和致死的重要原因。然而，糖尿病的具體發(fā)病機制仍不完全清楚。因此，建立合適的糖尿病動物模型對闡明糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制至關(guān)重要。

目前，各種方法被用于制備糖尿病動物模型，包括外科胰腺切除、化學(xué)誘導(dǎo)、自發(fā)性糖尿病模型和轉(zhuǎn)基因動物。其中，應(yīng)用最廣泛的方法是鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病模型，適合長期觀察。STZ是一種含有亞硝基脲部分的化合物，通過以下機制選擇性損傷胰島β細胞:

1.胰島β細胞的直接破壞:主要在注射高劑量STZ后觀察到。注射STZ可導(dǎo)致β細胞內(nèi)輔酶I (NAD)濃度降低，使依賴NAD的能量和蛋白質(zhì)代謝停止，導(dǎo)致β細胞死亡。

2.誘導(dǎo)一氧化氮合成損傷胰島β細胞。

3.STZ激活自身免疫過程，進一步導(dǎo)致β細胞損傷:低劑量注射STZ可破壞少量胰島β細胞。死亡的β細胞可被作為抗原的巨噬細胞吞噬，導(dǎo)致TH1刺激因子的產(chǎn)生。TH1細胞系的這種優(yōu)勢導(dǎo)致胰島局部產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，促進炎性細胞的浸潤，并激活I(lǐng)L-1、TNF-α、IFN-γ、NO和H2O2等物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致細胞損傷。死亡的細胞可以作為自身抗原，再次呈遞到抗原呈遞細胞進行加工，導(dǎo)致釋放細胞因子，放大細胞損傷效應(yīng)，最終引發(fā)糖尿病。

Arcegen提供了非常成功的建模STZ (Cat#C331605):高純度≥ 98% (HPLC)。

1. 構(gòu)建STZ糖尿病模型的標準操作程序

1.1 動物準備

優(yōu)選使用雄性動物，因為雌性動物可能受到影響建模效率的激素因素的影響。研究表明，與雄性動物相比，雌性動物的建模率較低，死亡率可能較高，尤其是在I型糖尿病中。

對于I型糖尿病，通常可以根據(jù)體重選擇動物。建議使用體重在170-200克之間的大鼠和體重在17-22克之間的小鼠。在適應(yīng)環(huán)境1-2周后，動物應(yīng)禁食并在空腹時注射STZ，以獲得相對理想的造模率。

對于大鼠(如SD/Wistar)的II型糖尿病，應(yīng)選擇4-5周齡、體重90-100g的動物。它們應(yīng)該被喂食高脂肪、高糖的食物4-6周，直到它們的體重達到大約240-280克。對于小鼠(如C57/ICR/昆明小鼠)，應(yīng)選擇4-5周齡、體重16-20g的動物。它們應(yīng)該被喂以高脂肪、高糖的飲食4-6周，直到它們的體重達到大約30-35克。新獲得的動物或那些過渡到新環(huán)境的動物應(yīng)在選擇合適年齡/體重的動物之前用標準飲食喂養(yǎng)一周以適應(yīng)新環(huán)境，以轉(zhuǎn)換到高脂肪、高糖飲食繼續(xù)喂養(yǎng)。

造模成功率方面，大鼠推薦SD大鼠，小鼠推薦C57小鼠。

1.2 建模前飼養(yǎng)

建模前喂養(yǎng):對于通常發(fā)展更快的I型糖尿病模型，大鼠通常可以在適應(yīng)標準飲食喂養(yǎng)2周后開始建模。對于II型糖尿病模型:高脂肪飲食結(jié)合低劑量STZ給藥的誘導(dǎo)，建模前喂養(yǎng)包括提供高脂肪、高糖飲食以誘導(dǎo)胰島素抵抗。

1.3 試劑準備

① High-fat, high-sugar diet高脂高糖飲食

高脂高糖日糧由基礎(chǔ)嚙齒動物日糧與蔗糖、豬油、蛋黃按以下質(zhì)量比例混合而成:豬油10%、蔗糖20%、蛋黃粉10%、膽酸鈉0.5%、基礎(chǔ)日糧59.5%。

② STZ-檸檬酸鈉緩沖液制備

溶液A和溶液B的制備:稱取2.1 g檸檬酸(分子量:210.14)溶于100 mL雙蒸水中，制得溶液A；稱取2.94 g檸檬酸鈉(分子量:294.10)，溶于100 mL雙蒸水中，制得溶液B。

檸檬酸鈉緩沖液的制備:將溶液A和B按一定比例(1:1.32或1:1)混合，調(diào)節(jié)pH值至4.2-4.5，用0.22微米濾膜過濾除菌，所得溶液即為所需的檸檬酸鈉緩沖液。建議按需準備新鮮的。

稱取STZ凍干粉，將其置于干燥、無菌、覆有鋁箔的瓶中，置于冰上，并將其溶解于預(yù)冷的檸檬酸鈉緩沖液(1% w/v)中。使用0.22微米薄膜過濾器過濾滅菌。

注意事項

1.從-20°C冰箱中取出STZ凍干粉后，在室溫下干燥黑暗的地方讓其完全解凍約10分鐘(非常重要！)。

2.STZ不穩(wěn)定，容易失活。快速稱量所需量后，任何剩余的試劑應(yīng)保持干燥并避光。建議用干鋁箔(或錫紙)包裹。

3.在注射過程中，如果不精通該操作，應(yīng)避免一次完全溶解所有STZ。建議根據(jù)熟練程度分批溶解STZ，例如每批10或15只小鼠。或者，根據(jù)每組動物的數(shù)量預(yù)先稱量所需量的STZ，并將其分成若干份。

1.4 注射

根據(jù)動物的空腹體重對其進行腹膜內(nèi)或尾靜脈注射。與腹膜內(nèi)注射相比，尾靜脈注射具有更高的藥物利用效率，但更難以實施。如果不精通注射技術(shù)，注射應(yīng)在兩組之間交替進行，所有注射應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成。

對于I型糖尿病模型:對于小鼠，建議單次高劑量100-200 mg/kg，或多次低劑量20-50 mg/kg連續(xù)注射5天。 對于大鼠，建議單劑量為40-70毫克/千克。

對于II型糖尿病模型:在1-2個月的高糖高脂喂養(yǎng)后，建議小鼠接受70-120 mg/kg的單劑量。

對于大鼠，建議單劑量為25-40毫克/千克。

注意事項: 由于動物體重、禁食阻力、禁食時間、注射技術(shù)和飼養(yǎng)過程可能不同，因此有必要進行預(yù)實驗以確定合適的劑量。不要盲目遵循文獻劑量進行實驗。

1.5 注射后

注射STZ后，要給動物提供充足的水和食物(糖尿病嚙齒動物的基本生活特征)，每天更換墊料，保持籠子干燥。在居住期間，避免陽光直射，并盡可能頻繁地給籠子消毒。

注意事項: 在STZ誘導(dǎo)后，血糖水平的顯著波動發(fā)生在三個階段:短暫的高血糖癥(1-2小時)、短暫的低血糖癥(6-10小時)和持續(xù)的高血糖癥(> 72小時)。必須適當(dāng)?shù)匮a充胰島素和葡萄糖。

1.6 對不合格模型的補救

對于不符合所需標準的模型，在穩(wěn)定動物后，可以施用額外的STZ(通過腹膜內(nèi)注射，劑量為10-20 mg/kg，根據(jù)實際情況選擇合適的劑量)，或者等到血糖水平恢復(fù)正常后再施用常規(guī)劑量。但是，要達到預(yù)期的效果，往往需要在正常情況下重新建立模型。

2. STZ糖尿病模型的評價指標

1.一般指標: 多飲、多食、多尿癥狀和體重減輕。

2.其他指標: 空腹血糖水平、空腹血清胰島素水平、血清胰島素水平、胰島素敏感性、葡萄糖耐量等。

3.血清生化指標: 總膽固醇(T-Cho)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等。

4.組織病理學(xué)切片: 胰腺組織的病理切片。

3. STZ糖尿病模型失敗的可能原因

1.STZ質(zhì)量差: 用于建模的STZ純度應(yīng)不低于98%(經(jīng)高效液相色譜分析驗證)。

2.STZ滅活: STZ易水解，應(yīng)儲存在干燥的環(huán)境中，以防止水分吸收。粉末形式不應(yīng)在室溫下長時間放置，溶解的STZ非常不穩(wěn)定，在中性pH值下半衰期為15分鐘。建議在使用前立即制備STZ溶液，最好溶解在酸性pH值溶液中，最好在冰浴中溶解。

3.腹膜內(nèi)注射不正確: 未能正確注射到腹膜腔，導(dǎo)致注射到腸道等其他器官。 對于不符合預(yù)期標準的模型，建議再觀察3天。如果模型仍然不成功，建議重新管理STZ。

(有關(guān)使用STZ的更多信息，請訪問:https://www.Arcegen.com/products/detail/1002)

4. STZ-誘導(dǎo)的小/大白鼠高死亡率分析

1.低體重大鼠: 低體重大鼠更易受STZ誘導(dǎo)的不利影響。

2.水分攝入不足: 水分攝入不足會導(dǎo)致脫水，增加死亡風(fēng)險。

3.高血糖和低血糖: 高血糖和低血糖都會導(dǎo)致大鼠死亡。這可以通過注射胰島素或暫時補充葡萄糖來緩解:

通常會出現(xiàn)高血糖水平。胰島素補充包括在3-5天內(nèi)以每次注射2-3個單位的劑量施用中等作用的胰島素，例如NPH(中性魚精蛋白Hagedorn)胰島素，這通常會降低大鼠的死亡率。

對于禁食后出現(xiàn)的低血糖水平，可在建模后4小時給大鼠腹膜內(nèi)注射20%的葡萄糖，以防止注射期間因低血糖而死亡。

4.自殘: 在食物匱乏和供水不足的情況下，老鼠可能會同類相食，互相攻擊。因此，必須提供充足的食物和水，最好是從兩個不同的來源。

5.感染: 糖尿病大鼠尿量增加，導(dǎo)致被褥潮濕，增加了感染的風(fēng)險。與其他大鼠相比，糖尿病大鼠更容易感染，尤其是尿路感染和腹部感染。適當(dāng)?shù)男l(wèi)生習(xí)慣至關(guān)重要，如在侵入性操作(如腹膜內(nèi)或皮下注射和血糖檢測)前后經(jīng)常更換被褥和消毒。比如每次測血糖后，用四環(huán)素(或紅霉素軟膏)局部治療，防止感染。

5. 影響糖尿病建模的因素

影響糖尿病模型建立的因素包括STZ造模試劑的質(zhì)量、動物條件和給藥方法。具體來說，試劑的主要屬性包括純度、穩(wěn)定性和溶解性。動物狀況包括遺傳背景、性別、體重、飼養(yǎng)環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)。給藥方法包括給藥時間、間隔和途徑。差異化的因素導(dǎo)致差異化的造型效果。

6. STZ建模高成功率指南

關(guān)于STZ的儲存、溶解和等分的詳細說明，請參考https://www.Arcegen.com/products/detail/1002.

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