對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)們來(lái)說(shuō)，最不想遇到的就一定是污染，那各種各樣的細(xì)胞污染當(dāng)中，例如細(xì)菌污染、真菌污染、病毒污染、支原體污染等等，其中支原體污染是這些污染重最難以分辨、去除的污染之一，接下來(lái)我們將全方位來(lái)對(duì)支原體污染的知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)歸納。
Part1 支原體是啥？
支原體最早在1898年被發(fā)現(xiàn)，是沒(méi)有一類沒(méi)有細(xì)胞壁、高度多形性、可以穿過(guò)0.22μm濾芯的最小原核細(xì)胞微生物。支原體大小一般在0.1-0.3μm之間，體型介于細(xì)菌和病毒之間，可以在無(wú)生命的培養(yǎng)基中自行生長(zhǎng)繁殖，不需寄生，一般附著在皿瓶表面，對(duì)絕大多數(shù)抗生素有耐藥性。
根據(jù)研究數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞支原體污染的發(fā)生率超過(guò)了60%，而且，在細(xì)胞陪支原體污染之后，期初是沒(méi)有辦法發(fā)現(xiàn)細(xì)胞明顯的形態(tài)變化，不會(huì)出現(xiàn)明顯的培養(yǎng)基渾濁變色，也不會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，等發(fā)現(xiàn)異常的時(shí)候，細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)過(guò)多次傳代，甚至分不清是在哪一代保種是出現(xiàn)的污染，導(dǎo)致無(wú)法根治，只能從頭再來(lái)，所以，支原體污染是目前科研細(xì)胞培養(yǎng)中的一大難題。
Part2 細(xì)胞咋被污染的？
實(shí)驗(yàn)室中出現(xiàn)的支原體類型絕大多數(shù)都是以下四類：
口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無(wú)膽甾支原體。
實(shí)驗(yàn)室中出現(xiàn)的支原體污染途徑主要有以下幾種：
1、細(xì)胞間交叉支原體污染；
2、科研人員的口腔皮膚，在科研過(guò)程中沒(méi)有按要求做好無(wú)菌防護(hù)，通過(guò)口腔呼出的氣液體或皮膚上沾染實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)導(dǎo)致口腔支原體、發(fā)酵支原體和人型支原體的污染；
3、工作環(huán)境及實(shí)驗(yàn)器材污染，支原體在超凈臺(tái)或生物安全柜上存活的時(shí)間最多可以持續(xù)5天，這就意味著在五天內(nèi)有污染過(guò)的細(xì)胞在環(huán)境中進(jìn)行過(guò)操作，就可能會(huì)導(dǎo)致其余細(xì)胞也出現(xiàn)污染；
4、細(xì)胞培養(yǎng)試劑污染，精氨酸支原體以及無(wú)膽甾支原體主要來(lái)源就是胎牛血清以及新生牛血清，如果是豬源的胰酶，也可能存在豬鼻支原體；
5、滅菌不恰當(dāng)，沒(méi)有徹底滅菌，沒(méi)有均勻滅菌，存在衛(wèi)生死角等等也會(huì)導(dǎo)致支原體污染加劇。
Part3 如何判斷支原體污染
在細(xì)胞培養(yǎng)中，我們第一步是需要在以下幾種情況下去重點(diǎn)觀察細(xì)胞是否存在支原體污染：
1、細(xì)胞生長(zhǎng)變慢(原先生長(zhǎng)時(shí)間2天長(zhǎng)滿的細(xì)胞，花了4天還沒(méi)有長(zhǎng)滿);
2、細(xì)胞狀態(tài)變差(原先細(xì)胞狀態(tài)飽滿圓潤(rùn)立體，逐漸變瘦變扁);
3、細(xì)胞邊界模糊(細(xì)胞相互粘連，邊界不清晰無(wú)法分辨);
4、細(xì)胞形態(tài)異常(細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)拉絲鋪展等情況);
5、在上述情況出現(xiàn)的同時(shí)，培養(yǎng)基上清液澄澈、換液后細(xì)胞狀態(tài)依舊無(wú)改變。
但是要確定存在支原體污染，還是需要通過(guò)以下幾種方法：
1、微生物培養(yǎng)法：取懷疑存在支原體污染的細(xì)胞上清樣，在特殊瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃環(huán)境中孵育14天，陽(yáng)性情況會(huì)出現(xiàn)“煎蛋狀”菌落。
2、DNA熒光染色法:支原體中的DNA中主要以A-T為主，可以被Hoechst 33258染色，存在支原體污染的細(xì)胞染色后會(huì)明顯看到細(xì)胞周圍有許多大小相近的熒光小點(diǎn)或絲狀物，即表明存在支原體污染。
3、PCR法：通過(guò)擴(kuò)增支原體16S核糖體RNA基因，可以檢測(cè)多種支原體，操作相較更快速、準(zhǔn)確性也相對(duì)較高。