頂刊高光?輝煌里程碑

中喬新舟助力成果榮登國際頂刊，影響因子 42.5 再創(chuàng)新高！熱烈祝賀！

l 文獻(xiàn)標(biāo)題：Hijacking ERAD for targeted degradation of transmembrane proteins

l 研究單位：復(fù)旦大學(xué)發(fā)表

l 期刊：CELL

l 影響因子：42.5

期刊名稱：《CELL》

靶向蛋白降解（TPD）技術(shù)為藥物發(fā)現(xiàn)提供了巨大機(jī)遇，但降解跨膜（TM）靶點(diǎn)仍然充滿挑戰(zhàn)。由于TM蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上規(guī)范地折疊，我們假設(shè)利用ER相關(guān)降解（ERAD）可能實(shí)現(xiàn)TM蛋白的高效降解。在此，我們建立了一種TPD技術(shù)，將其命名為ERAD結(jié)合嵌合體（ERADECs），能夠高效降解TM靶點(diǎn)。我們鑒定了地奈德是SYVN1的結(jié)合劑，SYVN1是一種介導(dǎo)ERAD的ER E3連接酶。我們通過將去sonide與已知的PD-L1配體連接，設(shè)計了針對程序性死亡配體1（PD-L1）的ERADECs，并以高效能觀察到SYVN1和ERAD依賴的PD-L1降解。在功能上，這些ERADEC在腫瘤抑制和PD-L1降低作用上表現(xiàn)得比臨床使用的PD-L1抗體更為顯著。ERADEC的概念也可擴(kuò)展到其他膜靶點(diǎn)。我們共同建立了一種平臺技術(shù)，利用ERAD以極高的效率選擇性降解TM靶點(diǎn)。

我們榮幸地向長期使用中喬新舟細(xì)胞以及專用培養(yǎng)基的合作伙伴致以熱烈祝賀由復(fù)旦大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)完成的成果《Hijacking ERAD for targeted degradation of transmembrane proteins》發(fā)表于國際知名期刊《CELL》(IF=42.5)。在該研究中，作者團(tuán)隊(duì)選用了中喬新舟提供的A-375人惡性黑色素瘤細(xì)胞專用培養(yǎng)基（貨號：ZM0042），NCI-H1975人肺腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基（貨號：ZM0395），MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞（貨號：ZQ0118），NCI-H1975人肺腺癌細(xì)胞（貨號：ZQ0395），A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞（貨號：ZQ0042）用于關(guān)鍵細(xì)胞模型的培養(yǎng)。

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一、研究背景與科學(xué)問題

靶向蛋白降解（TPD）技術(shù)，如蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs），劫持細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制以選擇性降解目標(biāo)蛋白，并為藥物發(fā)現(xiàn)提供了有前景的新途徑。同時，這些方法在降解大多數(shù)跨膜（TM）蛋白方面面臨挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@些蛋白在很大程度上無法被這些TPD策略所啟動的降解機(jī)制接觸到。由于TM蛋白的重要性，科學(xué)家們已建立了幾種針對它們的TPD策略，例如溶酶體靶向嵌合體（LYTACs）、共價工程化納米抗體嵌合體（GlueTACs）、和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體靶向嵌合體（TransTACs）等，它們開辟了前所未有的機(jī)會。同時，所有這些技術(shù)都依賴于內(nèi)體-溶酶體途徑，因此受到回收內(nèi)體的影響，這些內(nèi)體傾向于將TM目標(biāo)回收回去，從而降低它們的降解效率。此外，這些目標(biāo)蛋白還會不斷被內(nèi)含新合成蛋白的細(xì)胞內(nèi)囊泡補(bǔ)充。最后，大多數(shù)TPD策略使用大分子生物物質(zhì)如抗體，而小分子化合物可能提供若干優(yōu)越特性，如更易遞送、更低成本、多用途應(yīng)用途徑、長儲存穩(wěn)定性，且通常不具有免疫原性。因此，建立能夠高效降解TM目標(biāo)的小分子TPD策略是非常需要的。大多數(shù)TM蛋白在合成過程中通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中折疊。然后它們被打包進(jìn)囊泡用于運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，隨后再到質(zhì)膜，在此過程中它們在孤立狀態(tài)下大多無法被降解酶和降解機(jī)制接觸。因此，它們通常對當(dāng)前劫持細(xì)胞內(nèi)降解機(jī)制（如泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）或自噬）的降解劑具有抗性。與此同時，由于跨膜（TM）蛋白通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中正確折疊，它們可以被ER相關(guān)降解（ERAD）所接觸。

二、核心優(yōu)勢

本研究建立“一種劫持ERAD的TPD策略“，ERAD是一條關(guān)鍵的降解通路，能夠通過多種不同途徑降解TM蛋白、分泌蛋白或錯誤折疊的胞質(zhì)蛋白。ERAD由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)的E3連接酶（ER-E3）通過對目標(biāo)蛋白的多泛素化（poly-Ub）啟動。在多泛素化之后，底物被p97/VCP（含瓜氨酸蛋白）ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)區(qū)，并在提取過程中由p97/VCP結(jié)合的去泛素化酶（DUBs）去泛素化，然后底物重新被泛素化并靶向蛋白酶體降解。在TPD領(lǐng)域中，ERAD在很大程度上被忽視，并且此前沒有利用ERAD劫持的TPD方法。團(tuán)隊(duì)假設(shè)，與ER-E3和目標(biāo)蛋白同時相互作用的化學(xué)嵌合體可能通過ERAD觸發(fā)選擇性降解，這在TPD中尚未被利用。基于這一假設(shè)以及意外發(fā)現(xiàn)的可與主要ER-E3 SYVN1相互作用的化學(xué)配體，建立了一種劫持ERAD的TPD策略，稱為ERAD-介導(dǎo)的嵌合體（ERADECs）。

三、實(shí)驗(yàn)方法與主要結(jié)果

1. 去索尼德被鑒定為SYVN1結(jié)合化合物

研究團(tuán)隊(duì)最近確定地塞尼德（desonide）是一種針對亨廷頓病（Huntington’s disease）致病突變型HTT蛋白（mHTT）的小分子降解劑。地塞尼德誘導(dǎo)mHTT多泛素化（poly-Ub）以增強(qiáng)其降解，因此我們使用小干擾RNA（siRNA）敲低測試了可能直接與mHTT相互作用的多泛素化相關(guān)酶的潛在參與（圖S1A和S1B）。這些酶的選擇基于HDinHD數(shù)據(jù)庫，并通過文獻(xiàn)確認(rèn)其在mHTT降解中可能的參與，這一作用通過地塞尼德誘導(dǎo)降低HEK293T細(xì)胞中外源表達(dá)的mHTT exon1 Q72片段來測量（圖S1A）。敲低SYVN1完全抵消了地塞尼德處理對mHTT水平的下降，提示SYVN1的參與（圖S1B），SYVN1是酵母Hrd1的哺乳動物同源物，也是ERAD中發(fā)揮主要作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)E3。我們進(jìn)一步通過測試mHTT的多泛素化證實(shí)了這一點(diǎn)，地塞尼德處理增強(qiáng)了多泛素化，而敲低SYVN1后這種效應(yīng)幾乎被阻斷（圖1A）。我們觀察到地塞尼德誘導(dǎo)的高分子量血凝素（HA）條帶增加，這與通過過表達(dá)泛素導(dǎo)致的mHTT多泛素化增加相對應(yīng)（圖S1C），從而確認(rèn)地塞尼德誘導(dǎo)mHTT多泛素化。為了測試其潛在機(jī)制，我們進(jìn)行了共免疫沉淀（coIP），觀察到地塞尼德處理增強(qiáng)了mHTT與SYVN1的相互作用（圖1B）。K6R突變（Q72K6R）對地塞尼德具有抗性，并且是已知的地塞尼德結(jié)合蛋白——糖皮質(zhì)激素。

圖1：地索奈德直接與SYVN1相互作用

l (A) 使用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行代表性免疫沉淀-西方印跡實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)染了所示的cDNA質(zhì)粒（24小時）和siRNA（48小時），然后用3 μM地索尼德（+）或含100 nM環(huán)氧霉素聯(lián)合處理的DMSO（-）對照處理24小時。

l (B) 使用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行代表性免疫沉淀-西方印跡實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)染了GR-FLAG、SYVN1-FLAG和mHTT-HA cDNA質(zhì)粒（36小時），然后僅用3 μM地索尼德（+）或DMSO（-）對照處理2小時，以避免隨后降解。

l (C) 代表性下拉實(shí)驗(yàn)，使用地塞米松-生物素（+）或生物素對照（-）與 A375 細(xì)胞孵育，通過西方印跡確認(rèn)其與 SYVN1 的相互作用。

l (D) 使用重組純化蛋白的代表性表面等離子體共振（SPR）檢測結(jié)果顯示，地塞米松-生物素而非生物素可直接與 SYVN1 相互作用。muGFP 蛋白被用作對照蛋白。

l (E) 類似于 (D)，但使用 MST 測定法測試 desonide-SYVN1 相互作用。α-突觸核蛋白-MBP 蛋白被用作對照蛋白。

l (F) 類似于 (E)，但使用 ITC 測定法。在本圖及以下圖的所有 Western 印跡中，未裁剪的凝膠圖像顯示在 Data S1 中。

2. 基于地塞米松的ERADECs能夠降低PD-L1蛋白水平

研究團(tuán)隊(duì)考慮將地塞米松連接到已知的TM蛋白靶點(diǎn)的配體/抑制劑上，以驗(yàn)證ERADEC的概念。通過比較地塞米松和其他保留或消除了SYVN1結(jié)合的GR激動劑的結(jié)構(gòu)（圖1E、1F、S1E和S1F），并考慮到將生物素連接到地塞米松的C-20位置并未破壞SYVN1結(jié)合（圖1C），C-21羥基可能不是SYVN1結(jié)合所必需的，并可用于連接鏈接物以合成潛在的ERADEC。 因此，我們通過將地塞米松與PD-L1配體BMS-202連接（圖2A），生成了靶向程序性死亡配體1（PD-L1）的ERADEC，并測試了它們對PD-L1水平的影響（圖2B和2C）。值得注意的是，10種不同的靶向PD-L1的ERADEC（P-ERADEC P1–P4和P8–P13）在MDA-MB-231和A375細(xì)胞中以pM–nM濃度范圍顯著降低了PD-L1水平（圖2B和2C；數(shù)據(jù)S2A和S2B）。然而，一些僅含柔性聚乙二醇（PEG）鏈接物的P-ERADEC（P5–P7）未能降低PD-L1（圖2C；數(shù)據(jù)S2B）。大多數(shù)有效的含酯鏈接物的P-ERADEC表現(xiàn)出亞nM的DC50和>90%的Dmax，而含酰胺鏈接物的P-ERADEC P12和P13對細(xì)胞內(nèi)水解更具抵抗力，其效力和效能類似（圖2B和2C）。我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)分析完整A375細(xì)胞確認(rèn)了質(zhì)膜PD-L1水平的下降（圖2D）。P2誘導(dǎo)的PD-L1下降相對較慢（超過12小時）（圖2E），這可能是因?yàn)镋RADEC主要直接降解靶蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池而非跨膜池。

圖2. 基于地塞米松的ERADECs降低A375細(xì)胞中的PD-L1蛋白水平

l (A) P-ERADECs 的化合物設(shè)計圖和二維結(jié)構(gòu)。

l (B) 使用 A375 細(xì)胞在分別用指定濃度的 P1 或 P2 處理 48 小時后的代表性西方印跡及定量結(jié)果。

l (C) P-ERADECs 的 PD-L1 DC50（半最大降解濃度）和 Dmax（最大降解）的表格

l (D) 用流式細(xì)胞術(shù)分析 A375 細(xì)胞在用指定濃度 P2 處理 48 小時后的質(zhì)膜 PD-L1 蛋白水平。

l (E) 使用 A375 野生型（WT）細(xì)胞和 A375 SYVN1 敲除（KO）細(xì)胞，在有或沒有 50 nM P2 處理不同時間（分別為 2、4、6、12、24 和 48 小時）下的代表性西方印跡及定量分析。所有柱狀圖表示平均值 ± SEM。ns，p > 0.05；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

3. ERADECs 通過 SYVN1 和 ERAD 降低 PD-L1 蛋白水平

關(guān)于ERADECs特異性的一個擔(dān)憂是，我們當(dāng)前的彈頭，它可以作用于SYVN1，同時也是一個GR激動劑。GR不太可能介導(dǎo)降解效應(yīng)，因?yàn)槭褂昧硪环NGR激動劑潑尼松龍的化合物未能引起靶標(biāo)降解。

圖3. ERADECs 通過 SYVN1 和 ERAD 降低 PD-L1 蛋白水平

l (A) 在 MDA-MB-231 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染所示 siRNA 48 小時后，再用 500 nM P3 或 DMSO 對照處理 24 小時，對 PD-L1 水平進(jìn)行代表性免疫印跡及定量分析。

l (B) 類似于 (A)，但使用 U-251MG 細(xì)胞，有或沒有 SYVN1 基因敲除，處理 500 nM P8。

l (C) 使用轉(zhuǎn)染表達(dá) PD-L1-HA 和泛素質(zhì)粒的 U-251MG 細(xì)胞進(jìn)行代表性免疫共沉淀-免疫印跡及定量分析，以檢測 P2 誘導(dǎo)的 PD-L1 多聚泛素化。A375 細(xì)胞用 50 nM P2 處理 6 小時以誘導(dǎo)多聚泛素化，并用 500 nM CB5083 處理以防止多聚泛素化 PD-L1 的降解。

l (D) MDA-MB-231 細(xì)胞用所示化合物處理 48 小時后進(jìn)行代表性免疫印跡及定量分析。P3，500 nM；MG132，1 μM；氯喹 (CQ)，20 μM。

4. ERADECs 在涉及 Tyr227 的 TM 囊口中與 SYVN1 相互作用，并誘導(dǎo)三元復(fù)合物的形成

鑒于KDM5B促進(jìn)糖酵解，我們首先試圖將這一代謝性狀與下游信號傳導(dǎo)聯(lián)系起來。TCGA-PRAD數(shù)據(jù)集的GSEA顯示，高KDM5B表達(dá)組中“通過切合體進(jìn)行替代mRNA剪接”通路富集（ES = 0.6876，NP = 0.0000）。這促使我們假設(shè)KDM5B驅(qū)動的乳酸積累可能影響AR切割，從而產(chǎn)生抗性相關(guān)變異體AR-V7。支持這一觀點(diǎn)的是，在我們的小鼠CDX模型中，KDM5B敲低細(xì)胞的腫瘤組織乳酸水平較低。當(dāng)腫瘤組織接受乳酸處理時，AR-V7 mRNA水平隨時間和劑量變化增加，確立乳酸與AR-V7表達(dá)之間的直接聯(lián)系。

圖4. P-ERADECs 可能結(jié)合在 SYVN1 的 TM 域中的 TM3–8 口袋處

l (A) 代表性 MST 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純化的重組 SYVN1 TM1–8 域?qū)λ镜?P-ERADECs 表現(xiàn)出結(jié)合。

l (B) Desonide（碳原子顯示為青色）與 SYVN1（碳原子顯示為綠色）的前兩個分子對接模型。圖中顯示了 TM 結(jié)構(gòu)、氫鍵長度（埃）、以及參與的殘基（碳原子顯示為黃色）。

l  (C 和 D) 類似于 (A)，但使用所示的 SYVN1 TM 片段。

l (E) 使用過表達(dá)的 SYVN1 TM 片段進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)。對轉(zhuǎn)染了所示質(zhì)粒并在之后用 P2 處理 48 小時的 A375 細(xì)胞進(jìn)行的 Western 印跡及定量分析證實(shí)了競爭現(xiàn)象。柱狀圖表示均值 ± SEM。ns, p > 0.05；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。另見圖 S4–S7

5. PD-L1 ERADECs 的特異性

我們進(jìn)一步基于模型1和模型2，通過LigPlot分析了可能與地索尼德相互作用的SYVN1氨基酸（圖5A）。我們在一個構(gòu)建體中（SYVN1-5mut）或在各自的單獨(dú)構(gòu)建體中進(jìn)行預(yù)測參與地索尼德與SYVN1結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸突變（E87A、W118F、Y227F、L250S和Q254A）（圖5A），并在SYVN1敲除的U-251MG細(xì)胞中表達(dá)這些突變體或野生型（WT）全長SYVN1，以測試它們是否能夠恢復(fù)P-ERADEC的作用。與模型1預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)不一致，但與模型2預(yù)測一致，將全長SYVN1表達(dá)在SYVN1 KO U-251MG細(xì)胞中恢復(fù)了P-ERADEC P2處理下PD-L1的下降作用，而表達(dá)Y227F突變體或5突變SYVN1形式則未能實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)（圖5B、5C和S4E），將降解作用與化合物-SYVN1相互作用位點(diǎn)聯(lián)系起來，進(jìn)一步確認(rèn)了SYVN1的參與。結(jié)合位點(diǎn)通過直接生物物理實(shí)驗(yàn)檢測二元結(jié)合（通過MST和ITC）得到了進(jìn)一步確認(rèn)（圖5D和5E）。

圖5. P-ERADECs可能與SYVN1的Y227相互作用以誘導(dǎo)靶向降解

l 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析。用WT或K179R突變hnRNPA1重構(gòu)的hnRNPA1-KO EnzR細(xì)胞，使用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）（40微分）處理，可加乳酸或無乳酸（20微分）。西方印跡（A）和hnRNPA1半衰期（B）定量顯示乳酸穩(wěn)定WT，但不穩(wěn)定K179R hnRNPA1。

l 體內(nèi)泛素化檢測。Flag-hnRNPA1的泛素化在EnzR細(xì)胞中低于親本細(xì)胞（C）。乳酸處理（20uM）減少，而氧酸鈉（20uM）增加，hnRNPA1泛素化（D）。

l (A) 前兩名對接模型的配體-受體相互作用的計算機(jī)預(yù)測。綠色標(biāo)記的殘基參與氫鍵，其他殘基參與疏水相互作用。突變實(shí)驗(yàn)中的突變氨基酸以黑圈標(biāo)出。

l (B和C) 使用SYVN1敲除的U-251MG細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)染SYVN1 cDNA（有或沒有所示點(diǎn)突變的WT）24小時后，并用P2處理24小時的代表性免疫印跡(B)及其定量(C)。柱狀圖表示平均值 ± SEM。****p < 0.0001。

l (D) 使用重組純化蛋白的代表性MST實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SYVN1而非Y227F突變體表現(xiàn)出與P-ERADEC (P2或P11)的結(jié)合。

l (E) 類似于(D)，但使用ITC檢測地塞米松的結(jié)合。NBD，未檢測到結(jié)合。另見圖S5–S7。

四、總結(jié)

該研究建立了一種新型TPD策略，稱為ERADECs，它劫持了ERAD，這是一個尚未在其他TPD中利用的細(xì)胞內(nèi)降解途徑。多種P-ERADECs表現(xiàn)出亞納摩爾級的DC50和超過90%的D max，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)基于細(xì)胞質(zhì)E3的PD-L1靶向PROTACs，這些傳統(tǒng)方法通常表現(xiàn)為大于1 μM的DC50和約60%的D max。這可能是因?yàn)镻D-L1在ER中折疊，因此對細(xì)胞質(zhì)E3連接酶的可及性有限。膜PD-L1的自然半衰期約為3小時，表明膜中PD-L1部分降解迅速，降低了降解劑提升其降解的空間。總野生型PD-L1的半衰期約為17–18小時，稍長于P-ERADECs發(fā)揮作用所需的時間。ERADECs的體內(nèi)療效令人期待，表明具有良好的治療潛力。考慮到用于靶向ERADECs的SYVN1配體（地塞米松）親和力僅約為μM量級，ERADECs的療效仍有很大的進(jìn)一步提升空間。

五、關(guān)于中喬新舟

本研究中使用了中喬新舟的A-375人惡性黑色素瘤細(xì)胞專用培養(yǎng)基（貨號：ZM0042），NCI-H1975人肺腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基（貨號：ZM0395），MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞（貨號：ZQ0118），NCI-H1975人肺腺癌細(xì)胞（貨號：ZQ0395），A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞（貨號：ZQ0042），印證了高端科研對高品質(zhì)細(xì)胞以及專用試劑產(chǎn)品的要求。

中喬新舟提供品種豐富的細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品，主要分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，細(xì)胞系完全培養(yǎng)基，動物原代細(xì)胞完全培養(yǎng)基，人原代細(xì)胞完全培養(yǎng)基，永生化細(xì)胞完全培養(yǎng)基等。該系列產(chǎn)品均由公司技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)數(shù)年精心設(shè)計優(yōu)化，可保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。所有產(chǎn)品均有通過嚴(yán)格的質(zhì)控體系，經(jīng)過微生物檢測、PH值檢測、細(xì)跑生長驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)等確保了培養(yǎng)基質(zhì)量的穩(wěn)定性。

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