在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，檢測細(xì)胞增殖、毒性和活性至關(guān)重要。目前，常用的細(xì)胞增殖和活性檢測試劑通常基于細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶的還原能力，如MTT法、XTT法、WST-1法、CCK法等。

Arcegen Biology推出了基于WST-8的細(xì)胞活性檢測試劑盒——即細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（簡稱CCK試劑盒），與MTT相比具有更低的細(xì)胞毒性，檢測更靈敏，操作更簡便。
 

實(shí)驗(yàn)原理

WST-8 (2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt)可以被線粒體中的脫氫酶還原，在電子耦合試劑1-甲氧基PMS的存在下形成高度水溶性的橙黃色甲酰胺。顏色強(qiáng)度與細(xì)胞增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450納米波長下測量吸光度值（OD值），間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。

表1. CCK法與其他細(xì)胞增殖/毒性檢測方法的優(yōu)勢比較

產(chǎn)品特點(diǎn)

易用性：產(chǎn)品為液體，開瓶即用；甲酰胺可溶于水，無需用有機(jī)溶劑溶解。
高靈敏度：寬廣的線性范圍，高靈敏度，良好的重復(fù)性。
低細(xì)胞毒性：細(xì)胞毒性極低，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
良好的穩(wěn)定性：培養(yǎng)基中含酚紅和血清不影響檢測結(jié)果。
廣泛的適用性：適用于大規(guī)模、高通量的樣本測試。

應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、藥物篩選、腫瘤藥物敏感性測試、生物因子活性檢測等。

產(chǎn)品數(shù)據(jù)

與類似產(chǎn)品的性能比較

細(xì)胞類型：293T人胚腎細(xì)胞；

培養(yǎng)基：含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基；

孵育時(shí)間：3小時(shí)；細(xì)胞數(shù)量：1000。
 

參考已發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)

常見問題解答

Q1: CCK的儲存和穩(wěn)定性如何？

A1: CCK具有高穩(wěn)定性。在避光條件下，-20°C下有效期為2年，4°C下有效期為1年。對于頻繁使用的情況，建議在4°C下儲存，以避免反復(fù)凍融。CCK通常呈粉紅色，顏色的顯著變化可能表明質(zhì)量發(fā)生了變化。

Q2: CCK的細(xì)胞毒性如何？

A2：CCK的毒性非常低，這允許在CCK檢測之后使用相同的細(xì)胞進(jìn)行其他細(xì)胞增殖測試，例如結(jié)晶紫染色、中性紅染色或DNA熒光染色。

Q3: CCK會染色活細(xì)胞嗎？

A3: 不會，WST-8不會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行染色。整個顏色發(fā)展反應(yīng)都發(fā)生在培養(yǎng)體系中。此外，WST和WST-8形成的甲酰胺都是高度水溶性的，反應(yīng)結(jié)束后更換新鮮培養(yǎng)基可以去除外來成分。

Q4: 進(jìn)行細(xì)胞活性檢測時(shí)，每個孔應(yīng)該接種多少細(xì)胞？

A4：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)的96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為每個孔1000個細(xì)胞（100 μL培養(yǎng)基）。對于白細(xì)胞的檢測靈敏度相對較低，因此建議每個孔至少接種2500個細(xì)胞（100 μL培養(yǎng)基）。

Q5: 對于使用6孔或24孔板的實(shí)驗(yàn)，CCK試劑的用量是多少？

A5：對于使用6孔或24孔板的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)每孔所需的接種體積計(jì)算，并添加占每孔培養(yǎng)基總體積10%的CCK溶液。

Q6: 培養(yǎng)基中的背景顏色，如酚紅，會影響細(xì)胞活性檢測嗎？

A6：不會，計(jì)算時(shí)可以減去培養(yǎng)基中酚紅的吸光度，從而消除其對檢測的影響。

Q7: 384孔板能否用于細(xì)胞增殖和活性檢測實(shí)驗(yàn)？

A7: 是的，CCK-8產(chǎn)品的用量是每孔培養(yǎng)基總體積的10%。建議先將CCK-8產(chǎn)品稀釋一倍，然后添加到每孔培養(yǎng)基總體積的20%，以減少誤差。

Q8: 是否只能在450納米波長下測量OD值？

A8：OD值可以在450納米波長下測量，但如果沒有這個波長的濾光片，可以選擇430-490納米之間的吸收濾光片。不過，450納米的濾光片能提供更高的靈敏度。

Q9: 如果暫時(shí)不測量OD值應(yīng)該怎么辦？

A9：如果暫時(shí)不測量OD值，可以在每個孔中加入10 μL的0.1 M鹽酸溶液或1% w/v的SDS溶液，然后將培養(yǎng)板覆蓋并儲存在室溫避光處。在24小時(shí)內(nèi)測量不會導(dǎo)致吸光度發(fā)生變化。

Q10: 添加CCK-8時(shí)可以不更換培養(yǎng)基嗎？

A10：通常，在添加CCK-8時(shí)不需要更換培養(yǎng)基。但是，如果培養(yǎng)基中含有氧化還原物質(zhì)，可能會出現(xiàn)誤差，這時(shí)必須使用其他培養(yǎng)基。

Q11: 實(shí)驗(yàn)中遇到高OD值應(yīng)該怎么處理？

A11: 你可以減少加入CCK-8后的孵育時(shí)間。例如，你可以將加入CCK-8試劑后的孵育時(shí)間從2小時(shí)縮短到1小時(shí)。此外，你也可以適當(dāng)減少細(xì)胞數(shù)量。

Q12: 實(shí)驗(yàn)中遇到低OD值應(yīng)該怎么處理？

A12: 可以使用兩種方法：1. 適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量。2. 延長加入CCK-8試劑后的反應(yīng)時(shí)間。

Q13: 每次實(shí)驗(yàn)都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

A13: 建議這樣做。盡管使用的細(xì)胞是相同的，但它們的狀態(tài)可能會有所不同。對于狀態(tài)不同的細(xì)胞，建議每次都創(chuàng)建一個標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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