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在類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，很多研究者可能會(huì)遇到這樣的情況：干細(xì)胞過度自我更新，導(dǎo)致細(xì)胞類型單一而分化受限；又或者干細(xì)胞過度分化，增殖能力不足，難以維持類器官的長期培養(yǎng)。更為重要的是，器官在生物體內(nèi)也需要保持增殖與分化的平衡，如果不能很好的控制類器官的增殖與分化，也不能很好的模擬真正的器官。

那么，如何較好的平衡類器官的增殖與分化呢？

近期，一項(xiàng)發(fā)表在Nature Communications上的研究成果，為我們解決這個(gè)問題帶來了思路。該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種新型的腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在單一培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞快速生長和細(xì)胞多樣性的增加，盡可能地達(dá)到干細(xì)胞自我更新與分化之間的平衡。

該研究團(tuán)隊(duì)的研究思路如下：

假設(shè)增強(qiáng)類器官的分化潛能就是增強(qiáng)類器官干細(xì)胞的的分化潛能，為了建立兼具細(xì)胞多樣性和高增殖能力的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，首先，利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LGR5-mNeonGreen報(bào)告系統(tǒng)，篩選出能顯著提高LGR5+干細(xì)胞比例的小分子組合，并驗(yàn)證相應(yīng)培養(yǎng)條件下的細(xì)胞多樣性、和體內(nèi)器官的相似性，然后，在篩選出的最佳小分子組合培養(yǎng)條件下，通過施加抑制劑和其他小分子調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化和增殖之間的平衡，最終，得到能夠兼顧高增殖能力和細(xì)胞多樣性的人類小腸類器官（hSIO）系統(tǒng)。

基于這樣的研究思路，科研人員通過建立“干性”增強(qiáng)的類器官系統(tǒng)、小分子功能分析確認(rèn)以及信號(hào)通路分子調(diào)節(jié)等方法（可見附1），精確分析出調(diào)控哪些小分子和細(xì)胞因子的特定組合，可增強(qiáng)細(xì)胞多樣性分化，以及哪些信號(hào)分子組合，可增強(qiáng)細(xì)胞的特定分化，并對(duì)關(guān)鍵小分子的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探究。

可見平衡類器官的增殖與分化，并非一個(gè)簡單的實(shí)驗(yàn)，需要從類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的分子層面去進(jìn)行分析，才能最大程度地讓體外類器官模型向體內(nèi)器官靠近，得到理想的結(jié)果。

團(tuán)隊(duì)研究方法概述

建立“干性”增強(qiáng)的類器官系統(tǒng)：利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LGR5- mneongreen報(bào)告系統(tǒng)來標(biāo)記LGR5+干細(xì)胞，優(yōu)化小分子和生長因子的組合來模擬干細(xì)胞的體內(nèi)生態(tài)環(huán)境，發(fā)現(xiàn)曲古霉素A（TSA或T，HDAC抑制劑）、2-磷酸- l -抗壞血酸（pVc或p，維生素C）和CP673451 （CP或C，PDGFR抑制劑）這3個(gè)小分子（TpC）的組合可以顯著增加LGR5陽性細(xì)胞（腸道內(nèi)干細(xì)胞）的比例。

在TpC條件下產(chǎn)生多樣化和可塑性的細(xì)胞類型：單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析揭示了TpC系統(tǒng)生成的類器官在組成和結(jié)構(gòu)方面與體內(nèi)器官具有高度的相似性，TpC系統(tǒng)支持在類器官中產(chǎn)生動(dòng)態(tài)和可塑性的腸道細(xì)胞群，具有產(chǎn)生多譜系和經(jīng)歷細(xì)胞可塑性的潛力。

小分子在系統(tǒng)建立中發(fā)揮重要作用：通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色、RT-qPCR、scRNA-seq等分析細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)變化，確認(rèn)各小分子的作用機(jī)制。TSA通過靶向HDACMBD-NuRD復(fù)合物增強(qiáng)LGR5干細(xì)胞維持；iBET-151能夠可逆地促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制向分泌細(xì)胞分化。

施加特定的信號(hào)調(diào)節(jié)分子實(shí)現(xiàn)類器官譜系轉(zhuǎn)變：通過調(diào)節(jié)Wnt、Notch和BMP等信號(hào)通路，可逆地從分泌細(xì)胞分化轉(zhuǎn)變?yōu)樵鰪?qiáng)增殖的腸上皮細(xì)胞系，或單向分化為特定的腸道細(xì)胞類型。

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