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IHC 實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題
1、染色過(guò)強(qiáng)
原因：抗體濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
解決辦法：降低抗體滴度、抗體孵育時(shí)間：室溫1 小時(shí)或4 度過(guò)夜
原因：孵育溫度過(guò)高超過(guò)37 度
解決辦法：一般在室溫20-28 度
原因：DAB 顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高
解決辦法：顯色時(shí)間不超過(guò)5-12 分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)
2、非特異性背景染色
原因：操作過(guò)程中沖洗不充分
解決辦法：每步?jīng)_洗3 次每次5 分鐘
原因：組織中含過(guò)氧化物酶未阻斷
解決辦法：可再配置新鮮3%H2O2 封閉孵育時(shí)間延長(zhǎng)
原因：組織中含內(nèi)原性生物素
解決辦法：正常非免疫動(dòng)物血清再封閉
原因：血清蛋白封閉不充分
3、染色弱
原因：抗體濃度過(guò)低、孵育時(shí)間過(guò)短
解決辦法：提高抗體濃度、孵育時(shí)間不能少于60 分鐘
原因：操作中添加試劑時(shí)緩沖液未瀝干
解決辦法：每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋 （應(yīng)防止切片干燥）
原因：室溫太低，低于15 度
解決辦法：要改放在37 度孵育箱孵育30-60 分鐘或4 度冰箱過(guò)夜
原因：蛋白封閉過(guò)度
解決辦法：封閉不要超過(guò)12 分鐘
4、染色陰性
原因：操作步驟錯(cuò)誤
解決辦法：應(yīng)重試，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照
原因：組織中無(wú)抗原
解決辦法：設(shè)陽(yáng)性對(duì)照以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
原因：一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤
解決辦法：仔細(xì)確定一抗二抗種屬無(wú)誤