今天，BIOTREE 技術(shù)支持工程師Novenia 將和奮斗在實驗室的小伙伴們分享一篇關(guān)于代謝組學實驗過程中溶劑選擇的文章Tuning Metabolome Coverage in Reversed Phase LC?MS Metabolomics of MeOH Extracted Samples Using the Reconstitution Solvent Composition。這是一篇2017年發(fā)表在analytical chemistry的文章，影響因子6.042。
大家都知道做代謝組學實驗的時候，因為生物樣本中包含了太多的物質(zhì)，不可能使用一種儀器或者一種方法就可以把所有的物質(zhì)都檢測出來，所以衍生出非靶標代謝組學。
百趣代謝組學文獻分享，非靶標代謝組學的目的是盡可能多的檢測樣本中的代謝物，但是無論是GC 還是LC，都會碰到一個問題，就是什么溶劑可以將提取干燥過的代謝物盡可能多的復溶呢。小白可能會去看文獻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一千篇文章有一千種復溶溶劑，大神則會根據(jù)自己的經(jīng)驗來選擇復溶溶劑。終于，在2017年的某一天，有人站出來針對LCMS去做對比了，讓我們攜手去看一下這位大神的實驗結(jié)果吧！
百趣代謝組學文獻分享，首先，大神準備了三種樣本，40例人血清（20例健康，20例疾病），LB培養(yǎng)基以及沒有在正文結(jié)果中出現(xiàn)的酵母菌，用甲醇進行提取或者沉淀蛋白后干燥，再用不同比例以及不同pH的甲醇來進行復溶，最后用LC-qTOF進行檢測。詳情如下圖：
其次，讓我們一起來看一下實驗結(jié)果。
1復溶溶劑對檢測到的峰的影響
首先是LB培養(yǎng)基的結(jié)果。
Figure 1. Total number of detected metabolite features (y-axis) as a function of (top) the MeOH/H2O ratio expressed in % MeOH (x-axis) .
第一個圖是色譜圖的峰數(shù)量隨甲醇比例的變化，第二個是根據(jù)定性出來的代謝物峰面積做了個PCA模型，果然，明晃晃的數(shù)據(jù)顯示復溶試劑中甲醇的比例與代謝物的檢測具有明顯的關(guān)系，隨著甲醇比例的升高，可以檢測到的峰的數(shù)量在減少。
再看pH。
Figure 2. Total number of detected metabolite features (y-axis) as a function of (top) the MeOH/H2O ratio expressed in different pH.
這個數(shù)據(jù)就沒有那么明晃晃了，檢測出來的峰數(shù)量沒有肉眼可見的明顯差異，代謝物的峰面積雖然有個趨勢卻又有一些混亂看不清楚，所以大神決定將這個條件放棄，專心研究甲醇的比例。
百趣代謝組學文獻分享，接下來，大神將10種標準品加到LB培養(yǎng)基里，研究復溶溶劑與物質(zhì)極性有沒有關(guān)系。他在這里使用指數(shù)log P來表示物質(zhì)極性的大小，log P越大，極性越小。
雖然不知道為什么，但是感覺很厲害的樣子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)log P小于5的物質(zhì)的響應，如ATP、亞精胺都隨著甲醇比例的減小而增加，而log P為7的棕櫚酸則隨著甲醇比例的減小而減小，由此可見復溶溶劑的極性與物質(zhì)的極性是相關(guān)的。
Figure 3. Examples of EICs for selected spiked in metabolites in different MeOH ratios, as indicated by orange and blue.
最后，根據(jù)log P來預測了一下HMDB中的人血清的數(shù)據(jù)，這是一個預測的數(shù)據(jù)。
Figure 4. The predicted log P distribution (x-axis) of all known metabolites in human blood as listed in the Human Metabolome Database (HMDB).
對HMDB里面的大約13000中物質(zhì)按照極性進行分類，也就是給每個物質(zhì)一個預測的log P值，結(jié)果顯示log P小于5的有74%，也就是說極性大的物質(zhì)比較多，因此做血清實驗的時候，使用親水的溶劑更好。百趣代謝組學文獻分享，log P大于7的只占19%，表明使用親水的復溶溶劑可能難以將這些物質(zhì)檢測出來。
2不同比例甲醇復溶得到的代謝物的量的變化
Figure 5. Effect of reconstitution solvent composition on metabolome coverage.
首先非靶標檢測。用100%水和100%甲醇復溶，分別得到了檢測到的物質(zhì)列表，并作為接下來靶標實驗的目標物質(zhì)。
其次，用0%甲醇、50%甲醇、100%甲醇復溶，分別檢測非靶中得到的物質(zhì)。結(jié)果分析：50%甲醇與0%甲醇相比，fold change小于1的占57%,大于1的僅占5%；50%甲醇與100%甲醇相比，fold change不變的占61%，大于1 的占28%。結(jié)果表明用水提取時，干燥后加甲醇可能會導致物質(zhì)的丟失，而用甲醇提取時，干燥后加水的影響不大。
3復溶溶劑對差異物的影響
最后，大神研究了復溶溶劑對差異物的影響，畢竟我們做代謝組學就是為了尋找差異物。
Figure 6. Work flow for metabolomics comparison of MeOH extracts of serum from 20 healthy control individuals and 20 lymphoma patients using three different reconstitution mixtures.
通過兩組樣本的比較，使用了三種復溶溶劑，非靶標檢測最后得到的結(jié)果顯示差異很大。100%復溶后檢測可以找到6種差異物，然而50%甲醇以及100%甲醇沒有找到差異物。
Figure 7. Box-whisker plots for N-Acetyl-methionine which was one of the six metabolites that significantly differed between control and lymphoma patients (left).
然后大神就對其中一個物質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)這個物質(zhì)在50%甲醇及100%甲醇中峰型極差，尤其是100%甲醇中的峰型可能都不會被軟件定性為一個物質(zhì)。所以復溶溶劑對差異物的篩選有很大影響，選擇復溶溶劑是一件很重要的事。
好了，所有的實驗都做完了，也分析完了，那么最后我們能得到什么結(jié)論呢？
百趣代謝組學文獻分享，對于血清樣本來說，100%水的溶劑比較好，除此之外的其他樣本，親水的溶劑比較好。大家在投稿的時候有可能會被問為什么這么選擇復溶溶劑，那么這篇文章也許可以作為一個證明材料。
4文章延伸
小伙伴們知道文中貌美如花的PCA圖是用什么軟件完成的嗎？小編偷偷地告訴你喲，是神通廣大的SIMCA軟件。
SIMCA 軟件是目前國際上科研和監(jiān)管機構(gòu)普遍認可的多元變量統(tǒng)計分析軟件，并且已經(jīng)成為多元變量統(tǒng)計分析的標桿。百趣代謝組學文獻分享，針對多變量大數(shù)據(jù)集，SIMCA 可有效地進行模型構(gòu)建和分析，以獲得更透徹和深入的數(shù)據(jù)結(jié)果。通過模型構(gòu)建，可同時觀察所有數(shù)據(jù)變量，從而避免信息丟失，減少數(shù)據(jù)復雜性。為進一步探究數(shù)據(jù)價值，SIMCA 通過OPLS?、OPLS-DA?、O2PLS? 和PLS-TREE?等分析模塊可排除噪音以獲得有效數(shù)據(jù)，并進行可視化等對數(shù)據(jù)進行分類和預測，從而提供較優(yōu)的解決方案。