文章標(biāo)題：Plasma proteomics identifies S100A8/A9 as a novel biomarker and therapeutic target for fulminant myocarditis
發(fā)表期刊：Journal of Advanced Research
影響因子：13
研究概覽
圖1.研究設(shè)計(jì)概述
研究背景
心肌炎是一類病因多樣的炎癥性心肌病，致病誘因涵蓋各類微生物感染、自身免疫性疾病、藥物及心臟毒性物質(zhì)。暴發(fā)性心肌炎（Fulminant Myocarditis, FM）是急性心肌炎最危重的臨床表型，以病情快速進(jìn)展、高致死性為核心特征，已成為全球重大公共衛(wèi)生難題。深入探索其分子發(fā)病機(jī)制與針對性治療干預(yù)手段，對實(shí)現(xiàn) FM 的早期診斷、降低死亡率并優(yōu)化臨床治療策略具有重要意義。
臨床實(shí)踐中可常規(guī)檢測多種血漿成分，包括蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)、電解質(zhì)及藥物等，其中蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)室檢測最常用的分析類別。血漿蛋白質(zhì)組學(xué)憑借高通量、可重復(fù)、無創(chuàng)且可定量的技術(shù)優(yōu)勢，成為發(fā)掘疾病分子標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)的重要手段。然而當(dāng)前 FM 的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)在覆蓋范圍與特異性上仍較為有限，這凸顯了采用血漿蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)掘其新型生物標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)的關(guān)鍵意義。本項(xiàng)大樣本隊(duì)列研究旨在分析 FM 患者的血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，通過對驗(yàn)證隊(duì)列的分析與驗(yàn)證，最終選定 S100A8/A9 作為暴發(fā)性心肌炎的候選生物標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)。
研究結(jié)果
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納入隊(duì)列的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)與臨床特征
本研究共納入 260 名研究對象，含健康對照者與暴發(fā)性心肌炎組（FM）、非暴發(fā)性心肌炎組（NFM）、急性心肌梗死組（AMI）、急性失代償性心力衰竭組（ADHF）患者。研究設(shè)置發(fā)現(xiàn)隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列，發(fā)現(xiàn)隊(duì)列由健康對照者和 FM 患者組成，驗(yàn)證隊(duì)列則納入健康對照者及 FM、NFM、AMI、ADHF 各組患者，兩個(gè)隊(duì)列的臨床特征及主要治療方案詳見表 1。
發(fā)現(xiàn)隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列在年齡、性別分布等人口統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)方面無顯著差異。在兩個(gè)隊(duì)列中，F(xiàn)M 組的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）均顯著低于健康對照組，同時(shí) FM 組的高敏心肌肌鈣蛋白 I（hs-cTnI）和 N 末端 B 型利鈉肽原（NT-proBNP）水平均呈顯著升高趨勢。
表1.發(fā)現(xiàn)隊(duì)列與驗(yàn)證隊(duì)列的基線臨床特征
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暴發(fā)性心肌炎患者血漿蛋白質(zhì)組學(xué)揭示固有免疫過度激活與代謝紊亂
首先比較了 51 名健康受試者與 153 名 FM 患者之間的血漿蛋白水平（圖 2A），兩組間存在 45 個(gè)差異表達(dá)蛋白。此外還比較了同一 FM 患者治療前后、以及處于急性期和恢復(fù)期的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果（圖 2B-C），F(xiàn)M 患者在治療前與治療后組間存在 37 個(gè)差異表達(dá)蛋白，急性期與恢復(fù)期組間存在 70 個(gè)差異表達(dá)蛋白。
為進(jìn)一步確定 FM 進(jìn)展相關(guān)的敏感性和特異性血漿蛋白，通過對以下三組蛋白進(jìn)行交集分析：FM 患者較健康受試者顯著升高的蛋白、治療后較治療前顯著降低的蛋白以及恢復(fù)期較急性期顯著降低的蛋白，得到了 24 個(gè)重疊蛋白（圖 2D）。對這 24 個(gè)重疊蛋白進(jìn)行了 GO 和 KEGG 富集分析（圖 2E-F），研究結(jié)果表明，固有免疫激活和代謝紊亂是 FM 患者血漿差異表達(dá)蛋白的主要特征。此外，利用蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)追蹤了這 24 個(gè)重疊蛋白之間可能存在的相互作用（圖 2G），發(fā)現(xiàn)炎癥相關(guān)蛋白與代謝相關(guān)蛋白存在相互作用，這表明炎癥過度激活與代謝紊亂之間存在關(guān)聯(lián)。
圖2.發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中 FM 患者的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)綜合分析
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S100A8 和 S100A9 是暴發(fā)性心肌炎（FM）嚴(yán)重程度的預(yù)測因子
為探究 FM 患者中差異表達(dá)蛋白（DEPs）與心功能的關(guān)系，分析了 24 種關(guān)鍵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度與 LVEF、hs-cTnI、以及 NT-proBNP 水平之間的相關(guān)性（圖 2H）。結(jié)果顯示，S100A8 和 S100A9 的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度與心功能指標(biāo)的相關(guān)性最佳。值得注意的是，S100A8 和 S100A9 的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度之間存在極強(qiáng)的正相關(guān)性。另外檢測了 108 例 FM 患者的炎癥細(xì)胞因子水平，并按 S100A8/A9 標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度的 50 百分位將患者分為低、高強(qiáng)度組，研究結(jié)果表明，與低強(qiáng)度組相比，S100A8/A9 高強(qiáng)度組的 IL-1β、IL-2R、IL-6 和 IL-10 水平顯著升高。綜上所述，這些結(jié)果表明 S100A8/A9 在 FM 發(fā)病機(jī)制中對心功能障礙和全身性炎癥具有顯著的促進(jìn)作用。
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血漿 S100A8/A9 水平對 FM 的診斷效能
為進(jìn)一步驗(yàn)證 S100A8/A9 在 FM 患者血漿中的表達(dá)升高，并評估其對 FM 的診斷效能，針對上述獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中的健康對照組、FM 組、NFM 組、AMI 組、ADHF 組的研究對象，開展特異性診斷效能的驗(yàn)證分析（表 1）。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）定量分析觀察到，與其他疾病組和健康對照組相比，F(xiàn)M 患者入院樣本中的 S100A8、S100A9 以及 S100A8/A9 水平顯著升高（圖 3A-C）。此外，進(jìn)行 ROC 分析以評估診斷效能，分析表明入院時(shí)測量的血漿 S100A8/A9 水平能有效區(qū)分 FM 患者和 NFM 患者，顯示出較強(qiáng)的診斷性能（圖 3D）。另外，S100A8/A9 對 FM 患者和 AMI 患者具有良好的診斷效能（圖 3E），對 FM 患者和 ADHF 患者的診斷效能更優(yōu)（圖 3F）。研究結(jié)果明確表明，S100A8/A9 對 FM 的診斷性能優(yōu)于單獨(dú)的 S100A8 和 S100A9。
為驗(yàn)證先前的結(jié)果，進(jìn)一步研究了血漿蛋白（S100A8、S100A9 和 S100A8/A9）與臨床指標(biāo)（LVEF、hs-cTnI 和 NT-proBNP）之間的相關(guān)性。相關(guān)性分析顯示，血漿中 S100A8/A9 異二聚體水平與 LVEF 呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與血漿 hs-cTnI 呈強(qiáng)正相關(guān)，與 NT-proBNP 水平呈強(qiáng)正相關(guān)（圖 3G-I）。
根據(jù)住院時(shí)長將 FM 患者分為三組，并比較其血漿 S100A8/A9 水平。結(jié)果顯示，住院超過 14 天的 FM 患者入院時(shí)的 S100A8/A9 水平顯著高于另外兩組（圖 3J），這表明 S100A8/A9 水平升高與住院時(shí)間延長存在關(guān)聯(lián)。Kaplan-Meier 生存分析顯示，S100A8/A9 高水平組，其主要結(jié)局（心臟死亡和心臟移植復(fù)合終點(diǎn)）和次要結(jié)局（因心力衰竭或心肌炎導(dǎo)致的住院和急診就診）的發(fā)生率顯著更高（圖 3K-L），這提示入院時(shí)的血漿 S100A8/A9 水平對 FM 患者具有較好的臨床預(yù)后預(yù)測價(jià)值。
圖3.驗(yàn)證隊(duì)列中血漿 S100A8、S100A9 及 S100A8/A9 的診斷效能評價(jià)
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S100A8 和 S100A9 在 FM 小鼠心肌組織中表達(dá)升高
為進(jìn)一步研究暴發(fā)性心肌炎小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 的表達(dá)變化，本研究采用 CVB3 誘導(dǎo)構(gòu)建 BALB/c 暴發(fā)性心肌炎（FM）小鼠模型。首先，4D-FastDIA 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，與對照小鼠相比，CVB3 誘導(dǎo)的 FM 小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 的蛋白水平顯著升高（圖 4A-C）。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，CVB3 誘導(dǎo)的 FM 小鼠心臟中，S100A8 和 S100A9 的 mRNA 及蛋白水平均呈顯著升高趨勢（圖 4D-F）。與之前的觀察結(jié)果一致，免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，F(xiàn)M 小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 的相對熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，且部分 S100A8 和 S100A9 的熒光信號可重疊（圖 4G），這表明小鼠心肌組織中存在 S100A8/A9 異二聚體。此外，通過 ELISA 對小鼠血漿和心肌組織中 S100A8/A9 異二聚體水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測，結(jié)果表明其水平從 CVB3 感染的第一天開始升高，并在感染后第 7 天顯著達(dá)到峰值（圖 4H-I）。
圖4.CVB3 誘導(dǎo)的 FM 小鼠心肌組織中 S100A8 和 S100A9 表達(dá)升高
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S100A8/A9 抑制劑可改善 CVB3 誘導(dǎo)的 FM 小鼠的心功能障礙
ABR-238901 作為 S100A8/A9 的抑制劑，能抑制 S100A8/A9 與 TLR4 和 RAGE 的相互作用。為探究 S100A8/A9 阻斷在 FM 中的治療效果，研究人員向 CVB3 誘導(dǎo)的心肌炎小鼠腹腔注射了 ABR-238901（圖 5A）。生存分析顯示，ABR-238901 治療能顯著降低心肌炎小鼠的死亡率（圖 5B）。在誘發(fā)暴發(fā)性心肌炎后，小鼠在 7 天內(nèi)出現(xiàn)快速體重下降，而 ABR-238901 可部分逆轉(zhuǎn)這一情況（圖 5C）。更重要的是，ABR-238901 治療減輕了由病毒感染引起的心功能下降（圖 5D-F）。使用 Millar 導(dǎo)管進(jìn)行的血流動(dòng)力學(xué)分析顯示了類似的變化（圖 5G-H）。經(jīng) ABR-238901 治療后，心肌炎小鼠的心臟重量與體重比（HW/BW）得到部分恢復(fù)（圖 5I），同時(shí)心肌組織中心力衰竭標(biāo)志物腦鈉肽（BNP）的上調(diào)也被顯著抑制（圖 5J）。這些結(jié)果表明，阻斷 S100A8/A9 可緩解急性病毒性心肌炎中的心臟功能障礙。
圖5.ABR?238901 阻斷 S100A8/A9 可改善 CVB3 誘導(dǎo)的心肌炎相關(guān)心功能障礙
此外，心臟大體觀察結(jié)果顯示，ABR-238901 處理可減輕心肌炎小鼠的炎癥反應(yīng)（圖 6A）。盡管 CVB3 介導(dǎo)的急性心肌炎小鼠心肌組織中，IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-10、CXCL2、TNF-α、TGF-β 和 NLRP3 的 mRNA 及蛋白水平均顯著升高，但 ABR-238901 能夠顯著緩解這些升高（圖 6B–I）；同時(shí)，ABR-238901 還可減弱 CVB3 mRNA 水平的升高，但對 S100A8/A9 自身的 mRNA 水平無顯著影響。為進(jìn)一步明確小鼠心臟的炎癥浸潤和纖維化情況，進(jìn)行了 HE 染色和 Masson 三色染色，結(jié)果表明 ABR-238901 可顯著減輕炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化程度（圖 6J-M）。此外，在病毒性心肌炎期間，ABR-238901 還減輕了中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在心臟中的浸潤（圖 6N-Q）。
總之，在暴發(fā)性心肌炎期間，S100A8/A9 的釋放增加，通過作用于心肌細(xì)胞和先天性免疫細(xì)胞中的 TLR4 和 RAGE，導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生增多，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。ABR-238901 等 S100A8/A9 阻斷劑通過特異性阻斷 S100A8/A9 與其受體之間的相互作用，對暴發(fā)性心肌炎發(fā)揮治療作用（圖 6R）。
圖6.ABR?238901 可減輕心肌炎小鼠的炎癥反應(yīng)
研究結(jié)論
本研究檢測了 FM 患者的血漿蛋白，通過對差異表達(dá)蛋白的富集分析，觀察到 FM 患者存在明顯的固有免疫激活和代謝紊亂。在 FM 發(fā)病期間，S100A8、S100A9 以及 S100A8/A9 的水平與心功能指標(biāo)顯著相關(guān)，其中 S100A8/A9 異二聚體被確定為 FM 患者的重要生物標(biāo)志物，且具有良好的診斷性能。此外，血漿 S100A8/A9 水平升高的 FM 患者，其心源性死亡、心臟移植的發(fā)生率更高，因心力衰竭或心肌炎住院和急診就診的次數(shù)也更多。同時(shí)，在 CVB3 誘導(dǎo)的 FM 小鼠心肌組織中，S100A8 和 S100A9 的水平顯著升高；采用 ABR-238901 進(jìn)行S100A8/A9 阻斷治療，可有效減輕小鼠的急性炎癥反應(yīng)和心臟功能障礙，從而顯著降低 FM 小鼠的死亡率。