英文標(biāo)題：Exogenous fatty acid renders the improved salt tolerance in Zygosaccharomyces rouxii by altering lipid metabolism
發(fā)表期刊：LWT
影響因子：6.6
客戶單位：四川大學(xué)
百趣提供服務(wù)：非靶標(biāo)代謝流
研究背景
魯氏接合酵母（Z. rouxii）長期以來一直用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，與食品的高品質(zhì)和特殊風(fēng)味密切相關(guān)。此前研究表明，補充外源脂肪酸可以進一步增強 Z. rouxii 的耐鹽性。確切的機制尚未可知，可能假設(shè)是外源性脂肪酸調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改變細(xì)胞膜中脂質(zhì)的組成。故而，本研究旨在通過代謝流分析和脂質(zhì)組學(xué)探索相關(guān)機制。
研究結(jié)果
1、Z. rouxii 吸收同位素標(biāo)記的外源脂肪酸
代謝流分析結(jié)果顯示360種代謝物帶有同位素標(biāo)記，其中76種代謝物參與KEGG通路。富集分析結(jié)果可見（圖1A），同位素在代謝途徑中廣泛分布，特別是在脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑。KEGG map01100中可見（圖1B）同位素標(biāo)記的代謝物分布在六個代謝模塊。大多數(shù)代謝物參與脂質(zhì)代謝，如磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）和鞘氨醇（sphingosine，Sph）代謝、脂肪酸代謝、甾醇生物合成。除此之外，聚糖代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的生物合成以及氨基酸代謝中亦可見同位素標(biāo)記代謝物。在鹽脅迫下，這些代謝物之間的代謝通量普遍增加，具體體現(xiàn)在甲酰輔酶A、（3S）-檸檬酰輔酶A、脫磷輔酶A，NAD+、鞘氨醇和麥角甾醇等代謝物上。以上結(jié)果證實，進入細(xì)胞的外源脂肪酸參與脂質(zhì)合成和代謝，代謝物間的代謝通量增加。
圖1 鹽脅迫下Z. rouxii 中參與代謝的標(biāo)記代謝物的同位素比值和代謝通量分析
2、 外源脂肪酸調(diào)控鹽脅迫下Z. rouxii 的脂肪酰代謝通量
在鹽脅迫下 Z. rouxii 細(xì)胞內(nèi)共檢測到16種同位素標(biāo)記的脂肪酰基（圖2A）：除了外源脂肪酸C12:0，細(xì)胞內(nèi)還檢測到被標(biāo)記的C13:0、C14:0、C16:0等長鏈脂肪酸，這表明外源脂肪酸被細(xì)胞吸收后，作為前體參與了脂肪酸的碳鏈延長過程。此外，C14:1、C16:1、C18:1、C18:2和C18:3的標(biāo)記檢出提示外源脂肪酸可以調(diào)控不飽和脂肪酸的合成。與0 g/L NaCl相比，120 g/L NaCl脅迫下脂肪酰基的同位素比值增加，反映出Z. rouxii 在鹽脅迫下對外源脂肪酸的吸收能力增強（圖2B）。
圖2 鹽脅迫下Z. rouxii 中同位素標(biāo)記的脂肪酰基的同位素比值和代謝通量的變化分析
3、鹽脅迫和外源脂肪酸處理下Z. rouxii 的脂質(zhì)組學(xué)分析
研究人員采用PCA模型評估了鹽脅迫和補充外源脂肪酸后 Z. rouxii 中脂質(zhì)譜的變化。結(jié)果顯示，不同對比間組別分離度良好（圖3A-D）。火山圖可見120 g/L NaCl vs 0 g/L NaCl對比下差異脂質(zhì)數(shù)量最多，且在120 g/L NaCl脅迫下，多數(shù)脂質(zhì)含量增加。此外，添加了外源脂肪酸C12:0后，些許脂質(zhì)的含量發(fā)生變化（圖3E-H）。韋恩圖可見四個對比策略下的差異脂質(zhì)數(shù)量（圖3I），共有的4個差異脂質(zhì)是PC(14:0/18:0)、PC(14:0/16:0)、PI(16:0/16:1)和PS(16:0/22:5)。
鹽脅迫下，溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）占比降低，磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidyl ethanolamine，LPE）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）比例顯著增加。補充了外源性FA 12:0后，F(xiàn)A和二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）的比例有所提高（表1）。以上結(jié)果表明，鹽脅迫和外源脂肪酸處理下，Z. rouxii 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量發(fā)生了變化。
圖4 鹽脅迫和C12:0添加下Z. rouxii 的脂質(zhì)組學(xué)分析
表1 不同處理條件下脂質(zhì)類別的相對含量變化
4、鹽脅迫和外源脂肪酸處理下差異脂質(zhì)的分類分析
為了探究鹽脅迫和外源脂肪酸添加對Z. rouxii 脂質(zhì)代謝的影響，研究人員分析了差異脂質(zhì)的豐度變化（圖4）。變化最大的脂質(zhì)是PC、PE和PI。在120 g/L的NaCl脅迫下，多數(shù)脂質(zhì)的含量普遍增加，如DAG、FA、LPC、LPE、PC、PE、PI、PS、磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）。補充外源脂肪酸后，部分三酰甘油（triacylglycerol，TAG）豐度增加。
隨后，分析了鹽脅迫下Z. rouxii 細(xì)胞中前10種差異脂質(zhì)的不飽和度變化（圖5A），發(fā)現(xiàn)PA、PS、PE、PC和PG具有較高的不飽和度。在120 g/L NaCl脅迫下，總脂質(zhì)不飽和度顯著增加，當(dāng)補充了FA 12:0，脂質(zhì)不飽和度降低。添加脂肪酸后PI/PS值略有增加，而在鹽脅迫下這種變化不明顯（圖5B）。鹽脅迫下，PC/PE值下降，而添加脂肪酸后比值變化不顯著（圖5C）。
圖4 鹽脅迫下Z. rouxii 差異脂質(zhì)豐度的熱圖
圖5 差異脂質(zhì)不飽和指數(shù)和磷脂比值的變化
5、代謝流和脂質(zhì)組變化的聯(lián)合分析
為了進一步揭示外源性脂肪酸進入細(xì)胞后對脂質(zhì)合成和代謝的調(diào)控，研究人員對代謝通量和脂質(zhì)組變化進行了聯(lián)合分析。外源脂肪酸C12:0首先進入細(xì)胞參與膜脂肪酸的合成（圖6A）。然后，脂肪酸生成乙酰輔酶A，參與其他脂質(zhì)的合成，如DAG、TAG、PS、PE、PC等。最后，游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）通過β氧化產(chǎn)生ATP，為酵母細(xì)胞提供能量。所有這些脂質(zhì)的代謝通量均增加（圖6B），其中DAG和PS的提高了2倍以上。脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，鹽脅迫下脂質(zhì)FA、PE和PC豐度提高了1.5倍以上，進一步證實了代謝通量分析的結(jié)果。此外，代謝通量和脂質(zhì)組差異脂肪酸的皮爾森相關(guān)性分析（圖6C）表明，除了FA 13:0的代謝通量與FA 18:1、FA22:0的代謝通量以及FA 13:0的代謝通量與FA 16:1、FA18:1的脂質(zhì)組豐度呈負(fù)相關(guān)外，余主要呈正相關(guān)。特別是脂質(zhì)組學(xué)中的差異脂肪酸之間表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系。
圖6 鹽脅迫下補充外源脂肪酸影響 Z. rouxii 脂質(zhì)代謝通量和脂質(zhì)組變化的簡化示意圖
研究結(jié)論
本研究首次采用同位素標(biāo)記代謝流分析和擬靶向脂質(zhì)組學(xué)聯(lián)合，以探索外源性脂肪酸對脂質(zhì)合成和耐鹽性的影響。結(jié)果表明，¹³C標(biāo)記的脂肪酸在Z. rouxii 細(xì)胞中可以被檢測到，進一步證明了Z. rouxii 能吸收外源脂肪酸，且在鹽脅迫下吸收率更高。此外，還檢測到了同位素標(biāo)記的其他脂肪酸或脂質(zhì)，在鹽脅迫下多數(shù)代謝物的代謝通量增加，提示外源脂肪酸主要調(diào)控細(xì)胞的脂質(zhì)合成。此外，134種脂質(zhì)在鹽脅迫期間表現(xiàn)出不同的豐度。大多數(shù)脂質(zhì)豐度增加，總脂質(zhì)不飽和度提高。Z. rouxii 增強了整體脂質(zhì)的合成，提升了代謝通量和脂質(zhì)含量，進而抵抗鹽脅迫。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)為食品酵母中脂質(zhì)和脂質(zhì)衍生化學(xué)品的綠色生物制造生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。