Food Chem.(IF=9.8)|南農陳暄教授研究團隊多組學揭秘：云南“金花茶”的風味煉金術—匍匐散囊菌如何點“茶”成“香”？

文章標題：Co-critical golden-flower fungus (Eurotium repens) contributed to characteristic flavor formation of two Yunnan jinhua teas through jinhua formation during the storage

發表期刊：Food Chemistry

影響因子：9.8

合作單位：南京農業大學

百趣提供服務：風味組學（VOCs 頂空）、PRM精準植物廣靶、宏基因組測序

研究亮點

1. 鑒定匍匐散囊菌(Eurotium repens)為云南自然貯藏金花茶的共生關鍵優勢金花菌，推翻 “僅冠突散囊菌為金花菌” 的傳統認知，明確自然倉儲金花與人工發花的菌種差異。

2. 采用宏基因組+風味組+代謝組多組學聯用，闡明該菌通過糖苷水解、胡蘿卜素降解、類黃酮轉化，分別形成金花白茶 “金花菌香” 與金花熟普 “中藥香”，并改善茶湯醇厚感的分子機制。

3. 針對云南金花熟普+金花白茶開展系統研究，明確倉儲發花現象(JFDS)的獨特規律，為云南倉儲老茶品質調控、定向發花與風味改良提供科學支撐。

研究背景

倉儲發花現象(JFDS)在兩款云南茶中被發現，這兩款茶分別被定義為金花熟普洱茶(JRIPT)和金花白茶(JWT)。本研究構建了宏基因組、揮發性代謝組與非揮發性代謝組整合的多組學技術體系，旨在解析金花形成過程的作用機制。匍匐散囊菌(Eurotium repens)是一種介導金花形成的金花菌，其在云南金花茶中的相對豐度均超過50%。基于檢測到的291種揮發性有機化合物和83種氣味活性物質分析，匍匐散囊菌可直接促進糖苷水解與類胡蘿卜素降解，生成芳樟醇、β-紫羅蘭酮和3，4-脫氫-β-紫羅蘭酮，塑造金花白茶特有的金花菌香氣；在Arxula adeninivorans協同作用下，匍匐散囊菌的代謝活性通過促進倍半萜類和甲氧基苯類物質積累，賦予金花熟普洱茶獨特的藥香特征。此外，金花形成過程中匍匐散囊菌的代謝活動還會加速兒茶素的氧化聚合，以及其他黃酮類物質的轉化，進而提升茶葉的醇和口感。

研究結論

01.四種云南茶感官評價結果

初制工藝分別造就熟普洱茶(RIPT)、普通白茶(GWT)的獨特風味：渥堆發酵讓RIPT形成陳香與醇和口感，萎凋工藝則使GWT兼具花香、果香且帶輕微青草氣。長期貯藏能降低茶葉苦澀與鮮爽感、促進陳香形成，JFDS能進一步讓RIPT與JRIPT、GWT與JWT形成顯著風味差異，其中JWT的金花菌香、JRIPT的藥香特征尤為突出。

JFDS顯著提升JWT的花香、草本香和木質香強度，塑造典型金花菌香，還加速其苦澀感降低、青草氣消退。相較之下，因JRIPT在JFDS中的微生物活性低于普通熟普洱茶渥堆發酵階段，該過程對其滋味、湯色和葉底無顯著影響。總體而言，原料因素（茶樹品種、茶類、等級等）、金花菌菌種及工藝條件，均會影響金花菌香的形成。

02.匍匐散囊菌參與JRIPT和JWT的JFDS

2.1 真菌群落結構對比分析

測序獲938383條有效ITS序列，聚類得到341個真菌分類操作單元(OTUs)（圖1a），覆蓋率超99.90%，適用于微生物組學分析。渥堆發酵使RIPT的OTUs數遠低于GWT；且JFDS顯著降低真菌群落的多樣性指數以及基于Chao1指數的豐富度（圖1b）。本研究中JFDS降低真菌群落多樣性和豐富度的同時加速茶葉陳化，這與RIPT渥堆發酵、金花茶發花的真菌群落變化趨勢一致。

研究表明，JFDS使JRIPT與RIPT、JWT與GWT的真菌群落結構產生顯著差異（圖1c-d）。渥堆發酵中微生物的強烈代謝消耗了游離氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白等大部分營養物質，增加了JRIPT的JFDS難度；其中JRIPT在JFDS中的PCA總方差貢獻率約49.7%（圖1c），而JWT與GWT因JFDS產生的PCA總方差貢獻率達60.3%（圖1d）。

圖1. 四種云南茶葉間真菌群落結構的比較

2.2 與JFDS相關的特征真菌群落

本研究鑒定的OTUs歸為4門、20綱、46科、113屬、149種，與已有研究一致。熱圖分析可區分JRIPT與RIPT、JWT與GWT，表明JFDS在屬水平徹底改變自然貯藏茶葉的真菌群落組成；Eurotium、Blastobotrys、Wallemia、Aspergillus為優勢屬，其相對豐度(relative abundance, RA)在四款茶中差異顯著（圖2a-b）。JRIPT和JWT中高豐度的Eurotium參與JFDS，與金花茶發花的屬水平研究一致。受初制工藝影響，Blastobotrys為(J)RIPT第二優勢菌屬，Wallemia為JWT/GWT第二優勢菌屬；而JFDS分別降低了JRIPT中Blastobotrys、JWT中Wallemia的RA，表明其可徹底重構茶葉原有真菌群落結構。Aspergillus作為渥堆發酵核心功能菌群，在JRIPT中RA不足，說明JFDS與渥堆發酵的真菌群落演替趨勢不同。Eurotium與Blastobotrys、Wallemia呈極顯著強負相關，證實Eurotium在JFDS中對這兩類優勢菌屬存在抑制作用。

2.3 參與JFDS的核心金花菌

研究發現，JFDS徹底改變自然貯藏茶葉的真菌群落結構與組成；所有茶樣中檢測到的14種核心真菌，在(J)RIPT中RA合計超95%，在云南白茶中合計超80%。其中Eurotium與Blastobotrys為(J)RIPT優勢類群，Eurotium和Wallemia為云南白茶優勢類群（圖2c）。

匍匐散囊菌和嗜鹽散囊菌為JFDS潛在功能菌群，二者的RA在云南金花茶與對照茶樣間差異顯著（圖2d）；云南金花茶中匍匐散囊菌RA達51.5%~79.3%，嗜鹽散囊菌RA則在0.1%~2.4%，因此匍匐散囊菌是JRIPT和JWT中參與JFDS的核心金花菌，這與金花茶傳統發花的優勢菌種存在物種水平差異。

圖2. 云南四種茶葉中的共臨界真菌群落，以及金花真菌對JFDS的作用

03.JFDS對細菌群落結構的影響

測序獲899215條有效16S rRNA序列，聚類得1900個細菌OTUs（圖3a）；渥堆發酵使(J)RIPT細菌群落多樣性、豐富度低于云南白茶。JFDS對細菌群落影響較真菌有限，但仍顯著降低其多樣性與豐富度（圖3b）。PCA、PCoA、NMDS均證實JRIPT與RIPT、JWT與GWT的細菌群落結構差異顯著（圖3c-d），表明JFDS對細菌結構產生了深遠影響。

1900個細菌OTUs歸為29個門、90個綱、172個目、301個科、620個屬，云南白茶含27個門、468個屬，(J)RIPT含21個門、356個屬。對前30菌屬熱圖分析顯示JFDS改變了RIPT、GWT自然貯藏的細菌群落組成：JRIPT中芽孢桿菌屬RA從5.39%升至34.5%，葡萄球菌屬、克氏菌屬等RA降低（圖3e）；此外，JFDS使JWT中勞森氏菌屬、泛菌屬等RA提升，甲基桿菌-紅甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬RA顯著下降（圖3f）。

圖3. 四種云南茶葉間細菌群落結構的比較

04.四種云南茶葉的揮發性有機化合物譜圖特征及差異

4.1 揮發性有機化合物分類

通過HS-SPME-GC–MS檢測到291種高相似度揮發性有機化合物(VOCs)，歸為12類，烴類含量最高，其次為含氧雜環類、萜烯類等（圖4a）。受初制工藝（尤其是渥堆發酵）影響，(J)RIPT的VOCs種類和含量均低于云南白茶，如RIPT的VOCs總含量約為1670 μg/kg，不足GWT（3781 μg/kg）一半；渥堆發酵使醇類、酸類等含量降超70%，甲氧基苯類含量增加12倍，賦予RIPT陳香（圖4a）。

4.2 VOCs的熱圖分析與(O)PLS-DA

熱圖分析與PLS-DA均能有效分類鑒別四款云南茶，說明JFDS對VOCs譜圖的影響僅次于初制工藝（圖4b）。與對照茶樣相比，JFDS顯著提升JRIPT和JWT的VOCs總含量；該過程使兩款金花茶中萜類、含氧雜環類等化合物含量顯著升高，萜烯類、醇類、醛類含量顯著降低（圖4c）。

OPLS-DA模型對RIPT與JRIPT、GWT與JWT的VOCs譜圖鑒別效果良好（圖4d）。結果表明，在核心真菌的協同作用下，匍匐散囊菌在貯藏期金花形成過程中的代謝活動產生了大量差異揮發性有機化合物，可作為JRIPT和JWT的特征鑒別指標。

4.3 與JFDS相關的差異VOCs

因渥堆發酵后微生物活性降低，在共檢測的211種VOCs中，JRIPT的JFDS僅產生約20種差異VOCs（圖4d）。并且匍匐散囊菌通過酯化反應生成酯類/內酯類化合物，經酚類O-甲基化促進甲氧基苯類積累。云南白茶為JFDS微生物代謝提供充足營養，使JWT中6種萜類、3種萜烯類、3種內酯類及2,2,6-三甲基環己酮顯著上調，賦予JWT典型的金花菌香氣（圖4d）；同時6種酮類、5種醛類等顯著下調，降低其青草氣。綜上，云南茶香氣物質的分布特征及與JFDS相關的特征香氣物質，仍需深入研究。

圖4. 四種云南茶葉的VOCs分布特征及其JFDS效應

05.JFDS的特征香氣物質及其與核心真菌的相關性

5.1 云南茶葉的香氣物質分布

渥堆發酵顯著減少香氣物質種類、改變分布特征，使兩類茶44種香氣物質含量差異顯著。5種甲氧基苯類、10種萜類、8種倍半萜類、11種醛類、6種含氧雜環類化合物共同參與RIPT香氣形成（圖5a），其生成源于微生物介導的糖苷水解、單/倍半萜生物合成、類胡蘿卜素與酚酸降解及脂肪酸氧化反應。JFDS中，具草本香的α-扁柏烯、木質香的β-紫羅蘭酮等倍半萜OAV提升，與三甲氧基苯等甲氧基苯類協同，賦予JRIPT獨特藥香。

相較于GWT，JFDS顯著降低2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇的ACI值，減弱青草氣，為JWT金花菌香形成創造條件（圖5a）；同時提升2,2,6-三甲基環己酮、苯乙醇、芳樟醇氧化物、二氫獼猴桃內酯等含量，增強JWT果香。此外，JFDS中β-芳樟醇、藏紅花醛、β-大馬酮等具草本香、花香、木質香的萜類/萜烯類化合物OAV均上升，這類物質共同塑造了JWT的特征金花菌香。

5.2 JFDS的作用及金花菌香形成機制

本研究選取萜類、萜烯類、醛類為主的77種香氣物質，探究JFDS對云南金花茶特征風味的影響。JFDS中匍匐散囊菌在微生物協同作用下，推動JWT金花菌香與JRIPT藥香形成，其機制為：微生物介導芳樟醇糖苷水解提升β-芳樟醇含量；促進類胡蘿卜素降解氧化生成紫羅蘭酮、香葉基丙酮等；促使沒食子酸脫羧與O-甲基化。此外，JFDS通過芳樟醇氧化物糖苷水解提升3種芳樟醇氧化物OAV，這類物質與二氫獼猴桃內酯、己酸乙酯等內酯類、酯類物質積累協同，顯著增強JWT的果香。

5.3 核心真菌與特征香氣物質形成的相關性

如圖5b，匍匐散囊菌在云南金花茶特征風味形成中占主導，其與26種香氣物質呈極顯著正相關，促進了JWT的金花菌香。因匍匐散囊菌在JRIPT中相對豐度較低，其對該茶特征風味的直接參與受限；在RIPT中，與另一優勢菌Arxula adeninivorans的協同下，該菌通過提升倍半萜類、甲氧基苯類物質含量，間接促使JRIPT在JFDS中形成藥香。而優勢菌Wallemia canadensis在JFDS中推動2-甲基丁醛等物質含量降低，減弱了JWT的青草氣。

綜上，匍匐散囊菌通過促進糖苷水解和類胡蘿卜素降解推動JWT形成金花菌香，證實其在茶葉貯藏中的應用潛力；外源接種該菌，或可通過JFDS使云南白茶產生金花菌香、使RIPT產生藥香特征。

圖5. 四種云南茶葉中的氣味物質分布(a)，以及JFDS中14種共關鍵真菌與52種特征性氣味物質之間皮爾遜相關系數的熱圖(b)

06.JFDS中的黃酮類物質轉化

本研究經UHPLC–QTrap–MS/MS鑒定出165種黃酮類物質，含11種黃烷醇、35種黃酮醇等7類（圖6a）；其中黃烷醇類（兒茶素、原花青素）含量占主導，其次為黃酮醇、黃烷酮等。渥堆發酵已使(J)RIPT的黃烷醇、黃酮醇等含量偏低，而JFDS主要通過匍匐散囊菌的作用，顯著影響JRIPT和JWT的黃酮類物質代謝：該菌推動沒食子酰基化兒茶素水解為非沒食子酰基化兒茶素和沒食子酸，水解產物進一步氧化聚合、縮合，生成茶黃素等茶色素及多種原花青素（圖6b），既降低JWT苦澀感，又提升JRIPT醇和口感。沒食子酸還會經縮合、酯化轉化為鞣花酸和沒食子酸甲酯（圖6b）；同時匍匐散囊菌加速槲皮素-O-糖苷、花青素等多種糖苷類黃酮水解為苷元，這類物質的增加或能增強茶葉保健功效，如延緩認知衰退。結合微生物發酵潛在代謝途徑，匍匐散囊菌在JFDS中通過水解、羥基化、氫化、O-甲基化和糖基化反應，推動黃酮醇、黃烷酮、黃酮的代謝與相互轉化（圖6c）。

圖6. 165種檢出黃酮類化合物的分類與分布(a)、黃烷醇代謝過程(b)以及JFDS中黃酮醇、黃烷酮與黃酮的相互轉化關系(c) 

研究總結

本研究結合感官審評，構建宏基因組學、揮發性代謝組學與代謝組學整合的多組學體系，以JRIPT、JWT兩款云南金花茶為對象，與RIPT、GWT對照，系統闡明JFDS對云南金花茶風味形成的調控作用。研究表明，JFDS顯著降低微生物群落多樣性，使JWT形成金花菌香、JRIPT形成藥香；14種核心真菌中，JFDS關鍵金花菌匍匐散囊菌在兩款金花茶中豐度較高，且徹底改變了茶葉自然貯藏的微生物群落結構。基于291種VOCs與83種氣味活性物質分析，除渥堆發酵等初制工藝外，JFDS對茶葉VOCs譜圖和香氣物質分布也影響顯著。本研究為利用匍匐散囊菌及其他金花菌，通過JFDS改良茶葉風味提供了理論依據。

END

TQ 撰文

 Peng 校稿