摘要： 生物通報道，著名華人學(xué)者、哈佛大學(xué)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系謝曉亮（X Sunney Xie）教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將末端磷酸標(biāo)記的熒光核苷酸與可重復(fù)密封的微反應(yīng)器相結(jié)合，開發(fā)出一種多重邊合成邊測序的新技術(shù)。該成果近日發(fā)表在《Nature Methods》在線版上。
生物通報道，著名華人學(xué)者、哈佛大學(xué)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系謝曉亮（X Sunney Xie）教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將末端磷酸標(biāo)記的熒光核苷酸與可重復(fù)密封的微反應(yīng)器相結(jié)合，開發(fā)出一種多重邊合成邊測序的新技術(shù)。該成果近日發(fā)表在《Nature Methods》在線版上。
高通量測序近年來的蓬勃發(fā)展有望大大影響醫(yī)學(xué)的未來。然而，測序技術(shù)仍有很多方面有待改進(jìn)，如費用進(jìn)一步降低，以及樣品制備方面的改善。目前的測序技術(shù)主要分為兩類，一類使用原始的核苷酸，如羅氏454和Ion PGM測序儀；另一類則使用熒光標(biāo)記的核苷酸，如Illumina的HiSeq 2000，SOLiD和HeliScope等。
據(jù)作者介紹，這兩類測序技術(shù)各有優(yōu)缺點。焦磷酸測序和半導(dǎo)體測序中所使用的原始核苷酸允許原始DNA的合成，摻入后無需化學(xué)去除步驟。因此，測序過程相對較快，且焦磷酸測序能實現(xiàn)較長的讀長。但瞬時發(fā)光或電化學(xué)信號的檢測需要持續(xù)監(jiān)控，這限制了通量，而且往往不夠熒光檢測靈敏。
基于熒光的測序技術(shù)則實現(xiàn)了高通量。這些方法的可擴(kuò)展性能夠在每次運行中產(chǎn)生>1011個堿基，且熒光的固有靈敏度允許熒光測序方法所使用的DNA模板比焦磷酸方法低3個數(shù)量級，從而降低了試劑消耗和成本。然而，每個測序循環(huán)中多個化學(xué)步驟使流程更為復(fù)雜，限制了測序速度和讀長。
基于此，謝曉亮教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將以上兩種方法的優(yōu)勢結(jié)合起來，開發(fā)出了熒光焦磷酸測序。這種新方法使用末端磷酸標(biāo)記的熒光寡核苷酸（TPLFNs）和焦磷酸測序流程。熒光焦磷酸測序綜合了可擴(kuò)展性和快速運行時間。此外，微反應(yīng)器流動室平臺的試劑消耗少，也很容易整合到傳統(tǒng)微流體設(shè)備中進(jìn)行樣品制備。
研究人員在微反應(yīng)器中固定了帶引物的DNA模板，然后依次引入四個標(biāo)記TPLFNs中的一個，密封微反應(yīng)器，在模板指導(dǎo)的引物延伸后記錄熒光圖像。他們證實了在10分鐘的循環(huán)時間內(nèi)，讀長達(dá)30個堿基，且原始準(zhǔn)確率約為99%。
作者認(rèn)為，這種熒光焦磷酸測序既提供了焦磷酸測序的好處，如快速周轉(zhuǎn)，單色檢測等，又具有并行化的檢測靈敏度和簡便性。
謝曉亮教授是目前畢業(yè)于中國大陸高校并在國際學(xué)術(shù)界獲得高度評價的物理化學(xué)家之一。他上個月剛當(dāng)選美國科學(xué)院院士。他的研究組對離體實驗及活細(xì)胞內(nèi)生物系統(tǒng)在單分子水平的動力學(xué)研究具有重大貢獻(xiàn)，是這個領(lǐng)域快速發(fā)展的主要推動力之一，為生物學(xué)研究開辟了嶄新的途徑。謝曉亮研究組的工作大幅提高改良了單分子熒光顯微技術(shù)，特別是在相干拉曼顯微成像技術(shù)(CARS、SRS等)的發(fā)展及在生命科學(xué)的應(yīng)用方面作出了開創(chuàng)性的巨大貢獻(xiàn)。（生物通 薄荷）
原文檢索：
Fluorogenic DNA sequencing in PDMS microreactors
Nature Methods (2011) doi:10.1038/nmeth.1629
摘要：
We developed a multiplex sequencing-by-synthesis method combining terminal phosphate–labeled fluorogenic nucleotides (TPLFNs) and resealable polydimethylsiloxane (PDMS) microreactors. In the presence of phosphatase, primer extension by DNA polymerase using nonfluorescent TPLFNs generates fluorophores, which are confined in the microreactors and detected. We immobilized primed DNA templates in the microreactors, then sequentially introduced one of the four identically labeled TPLFNs, sealed the microreactors and recorded a fluorescence image after template-directed primer extension. With cycle times of <10 min, we demonstrate 30 base reads with ~99% raw accuracy. Our 'fluorogenic pyrosequencing' offers benefits of pyrosequencing, such as rapid turnaround, one-color detection and generation of native DNA, along with high detection sensitivity and simplicity of parallelization because simultaneous real-time monitoring of all microreactors is not required.