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生物通報道 一種可利用導向RNA分子靶向裂解DNA的細菌酶，一直以來被用作為一種可編程工具，位點特異性修改從細菌、人類細胞到斑馬魚等生物及細胞的基因組。生物通 在1987年的一篇論文中，日本大阪大學的研究人員報告了一項表面上微不足道的研究發現。他們在調查一種編碼堿性磷酸酶的細菌基因序列時，發現了鄰近的一個不同尋常的DN**段，這一DN**段中間是一段短直接重復核苷酸序列，兩側為短特異片段。他們當時指出“這些序列的生物學意義尚不清楚”。在幾乎過去快30年后，這一最初看起來不起眼的研究發現，現在為簡易操控大量生物體的基因組打開了大門。
近期，《科學》（Science）和《自然生物技術》（Nature Biotechnology）雜志上，接連發表了5篇研究論文，報告了研究人員現在稱之為CRISPR–Cas系統的這一細菌序列的應用，它成為了基因組編輯的一個簡單通用工具。生物通 PCR技術邁入第三代 Bio-Rad推出QX100? 微滴式數字PCR系統，詳細資料免費獲得>> >>
隨著近幾十年來全基因組測序常規化，在很多的細菌和古細菌中發現了包含CRISPR序列的區域和CRISPR相關(Cas)基因。發現這些短獨特序列能與病毒或質粒DNA序列相匹配，表明CRISPR–Cas系統能夠編碼“適應性”免疫系統，提供特異防御對抗入侵者。隨后的遺傳和生物化學實驗證實了這一猜測，表明CRISPR–Cas允許檢測和防止移動遺傳元件。生物通 盡管一些CRISPR–Cas系統需要多種蛋白才能發揮功能，在許多細菌中發現的II型系統卻只需利用一種內切核酸酶Cas9。該酶與導向RNA協同作用定位在PAMs保守序列限定的位點，裂解入侵DNA。為了形成功能性的DNA靶向復合物，Cas9需要兩種不同的RNA轉錄物，crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（CRISPR RNA）。然而，近期的研究表明，這樣的雙RNA可以重新裝配成一種單導向RNA （single-guide RNA，sgRNA)，其包含的序列足以編程Cas9，介導靶DNA雙鏈斷裂。
新的研究論文表明，RNA導向Cas9可以在多種細胞和生物體中發揮功能，在特異位點裂解完整基因組。這一點使得它具有基因組編輯的潛能。當借助于同源重組或是非同源末端連接，這些標準的細胞修復機制修復雙鏈斷裂時，可以此修改修復位點的序列，或插入新的遺傳信息。生物通 近期的三項研究證實RNA編程Cas9可以在人類細胞中發揮功能。美國哈佛-麻省理工Broad 研究所、哈佛大學醫學院和首爾大學的三個獨立研究小組，設計出了來自產膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9酶版本，它能在人類細胞核中維持活性。研究人員還設計出了雙RNAs或 sgRNAs，它們包含著與人類靶DNA序列互補的20個核苷酸序列。當研究人員在各種人類細胞系中表達這種“人源化” Cas9和導向RNAs時，他們觀察到靶DNA發生了預期的改變，介導了雙鏈斷裂及隨后的修復。這種基因打靶成功率高達38%，只伴隨有低水平的Cas9毒性。這種RNA導向Cas9還可有效觸發人類細胞中正常基因組位點的靶向性基因置換。
早先的研究發現，單鏈RNA斷裂有利于同源重組，以及減少脫靶突變。基于此，美國哈佛-麻省理工Broad 研究所和哈佛大學醫學院研究人員還對Cas9進行測試。發現突變酶非同源末端連接效率較低，但同源重組觸發的基因置換和野生型內切核酸酶一樣有效。兩個小組還進一步證實了該系統在“多路”靶向中的功能；sgRNA編程Cas9可結合兩種不同的基因組序列，其表達可導致不止一個靶位點序列斷裂。此外，Broad 研究所的研究人員還證實單獨表達原來雙tracrRNA–crRNA組合中的兩個RNA元件，基因破壞效率能夠進一步提高。這一研究發現表明改良sgRNAs或許可使它們更好地模擬雙RNA結構。生物通 除了這些在細胞系中獲得的研究結果，洛克菲勒大學的研究人員還利用RNA導向的Cas9操縱了完整生物體的基因組。他們證實通過在單細胞中采用不同的幾種導向RNA編程Cas9，可在細菌中使用這一系統修改多個位點。此外，麻省總醫院的研究人員證實將Cas9編碼mRNA和適當的導向RNAs注入到單細胞期胚胎中，在所有測試胚胎中導致了10個位點中的8個發生了高頻率(24–59%)的靶向性插入和刪除。這些研究結果表明，RNA導向Cas9可能能夠用于操縱其他的多細胞生物，包括哺乳動物和植物。該技術另一個最讓人感到興奮的潛在應用是，為生成人類疾病動物模型提供了一種簡單的方法。
利用RNA可編程Cas9進行基因組操作，有望廣泛應用于合成生物學、直接和多路干擾基因網絡，體內外靶向性基因治療。下一個挑戰將是分析和解決可能出現的脫靶效應，提高系統效率和特異性，擴大應用到其他生物體。就這方面而言，比較RNA編程Cas9與現有的基因編輯工具，包括大范圍核酸酶、ZFNs和TALENs將具有極重要的意義。除了基因組編輯，這一方法可為利用失活性Cas9導致轉錄性基因沉默，或工程操作Cas9獲得轉錄激活等新功能提供了可能性。限制性酶和耐熱聚合酶等細菌系統的發現及應用，在過去徹底改變了分子生物學。有了RNA導向Cas9酶，細菌現在為我們提供了重新基因組序列信息的一個通用工具，其具有在生物技術和醫學中改造基因組工程景觀的潛力 。來源：生物通