眾所周知Co-IP（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復(fù)合體的一項(xiàng)技術(shù)，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。由于過(guò)程中采用了非變性條件，保留了互作及復(fù)合體的細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)。相對(duì)于酵母雙雜交、pull down等方法，其特色之一便是捕獲的蛋白互作發(fā)生在所研究的特定組織細(xì)胞內(nèi)，保存了互作蛋白及復(fù)合體的“內(nèi)源”狀態(tài)。本文重在介紹Co-IP同蛋白質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，進(jìn)行高效篩選鑒定未知互作蛋白。
經(jīng)典Co-IP流程在收集捕獲產(chǎn)物之后，通過(guò)SDS-PAGE、銀染分析差異條帶、Western Blot來(lái)鑒定某些預(yù)設(shè)的互作蛋白。這種途徑限于通量、抗體等因素，適合點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。CoIP-MS即為將免疫共沉淀和蛋白質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)，運(yùn)用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)Co-IP所捕獲的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析的技術(shù)。相比于MALDI-TOF， LC-MS/MS方法具有更高的靈敏度和幾乎100%的可靠性，是主流文獻(xiàn)中最常用的方法。
在對(duì)樣本進(jìn)行非變性條件的蛋白提取之后，Co-IP所獲產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分離不同大小的蛋白，蛋白質(zhì)還原烷基化及酶解，除鹽之后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS/MS鑒定，將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲取產(chǎn)物中蛋白信息。之后再進(jìn)一步進(jìn)行對(duì)照組及樣品組的韋恩分析，鑒定蛋白質(zhì)的GO、COG和KEGG注釋分析，以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能，揭示蛋白質(zhì)在各個(gè)生命活動(dòng)中的生物學(xué)意義。
（引自Keller-Pinter A, Ughy B, Domoki M,et al. The phosphomimetic mutation of syndecan-4 binds and inhibits Tiam1 modulating Rac1 activity in PDZ interaction-dependent manner. PLoS One. 2017 Nov 9;12(11):e0187094.）
1. 樣品蛋白提取
為了保持目的蛋白本身及其互作蛋白、復(fù)合體的天然狀態(tài)，不遺漏互作蛋白信息，Co-IP樣品的蛋白提取應(yīng)注意：不使用SDS、Sodium deoxycholate等離子型去垢劑，不能使用尿素、硫脲等強(qiáng)變性劑，也不能經(jīng)過(guò)丙酮/TCA沉淀等導(dǎo)致蛋白變性的有機(jī)試劑處理。只能使用如NP-40、Triton X-100等非離子型去垢劑。此外，包括凍融、超聲處理等條件也會(huì)不同程度破壞蛋白復(fù)合物的存在狀態(tài)。因此，如何既保護(hù)蛋白活性又獲取較高的提取效率，需要借助經(jīng)驗(yàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)條件。
2. 免疫共沉淀Co-IP
在Co-IP過(guò)程中，除了所用抗體性能達(dá)到IP級(jí)別的親和力是先決條件之外，孵育體系中的總蛋白濃度、抗體用量、漂洗條件等方面也決定Co-IP過(guò)程的靈敏度以及特異性。通?？偟鞍诐舛刃枰?/span>1mg/ml，當(dāng)總蛋白濃度足夠高時(shí)，可以適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣品以降低其中去垢劑濃度，為抗體反應(yīng)提供溫和環(huán)境。使用protein A/G的磁珠或凝膠時(shí)不宜貪多，目前商品化產(chǎn)品其載量都在50ul用量時(shí)承載50ug或更多抗體，而通常一個(gè)Co-IP反應(yīng)的用量在1-3ug左右。漂洗緩沖液需要控制適當(dāng)?shù)柠}離子強(qiáng)度、去垢劑種類(lèi)及濃度，通常會(huì)延用裂解液緩沖液配方，因?yàn)楸尘暗鞍自诤罄m(xù)質(zhì)譜過(guò)程中會(huì)干擾蛋白的鑒定，優(yōu)化漂洗緩沖液的目的是既保持目的蛋白復(fù)合物的捕獲效率又盡量減少非特異結(jié)合蛋白。
3. 質(zhì)譜上機(jī)前樣本處理
蛋白質(zhì)還原烷基化和酶解。蛋白質(zhì)的還原烷基化如下，加入二硫蘇糖醇(DTT)還原蛋白質(zhì)，再加入碘乙酸銨(IAM)，最后加入Trypsin酶，過(guò)夜酶解，酶解后處理。酶解產(chǎn)生的多肽用C18柱子除鹽，已經(jīng)除鹽的多肽抽干后用Loading Buffer (含甲酸、乙*)溶解多肽。多肽上LC-MS/MS儀器進(jìn)行分析，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。
（引自Chen R, Xiao M, Gao H, et al. Identification of a novel mitochondrial interacting protein of C1QBP using subcellular fractionation coupled with CoIP-MS.[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2016, 408(6):1557-1564.）
4. 數(shù)據(jù)檢索、蛋白鑒定
LC-MS/MS下機(jī)后，將原始下載數(shù)據(jù)直接提交到與質(zhì)譜儀連接的Proteinpilot軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，過(guò)濾掉常見(jiàn)污染蛋白及與之匹配的肽段，得到每個(gè)樣品鑒定到的肽段和蛋白結(jié)果。通常CoIP-MS是將IgG組及IP同時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，得到的反應(yīng)兩組蛋白差異的韋恩圖。
5. 鑒定蛋白功能注釋
對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO、COG和KEGG注釋分析，以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能，揭示蛋白質(zhì)在各個(gè)生命活動(dòng)中的生物學(xué)意義。其中，GO分析總共有三個(gè)本體（ontology），分別描述基因的分子功能（molecular function）、細(xì)胞組分（cellular component）、參與的生物過(guò)程（biological process）；COG是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類(lèi)的數(shù)據(jù)庫(kù)；KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Pathway分析能確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。