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小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層（Mouse primary motor cortex，MOp）是額葉的一部分，主要負(fù)責(zé)計(jì)劃、控制、運(yùn)動(dòng)執(zhí)行，尤其是任何延遲反應(yīng)有關(guān)的動(dòng)作。在垂直方向上，皮層可以分為L(zhǎng)1-L6六層，每層的形態(tài)和功能都有區(qū)別。大腦皮層的谷氨酸能神經(jīng)元按其投射特性分為腦內(nèi)(IT)神經(jīng)元、大腦下投射神經(jīng)元(或錐體束神經(jīng)元)和皮質(zhì)丘腦投射(CT)神經(jīng)元；γ-氨基丁酸(Gaba)能神經(jīng)元可以根據(jù)發(fā)育起源于內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起和尾神經(jīng)節(jié)隆起進(jìn)行分類，并可以通過小白蛋白(Pvalb)、生長(zhǎng)抑素(Sst)、血管活性腸肽(Vip)和Lamp5等標(biāo)記基因進(jìn)一步分類。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究揭示了大腦細(xì)胞的高度多樣性，并報(bào)道了在單個(gè)皮層區(qū)域中存在數(shù)十到上百種細(xì)胞類型。然而，想要了解不同類型細(xì)胞對(duì)大腦功能的作用仍然缺乏一個(gè)高分辨率、包含細(xì)胞空間組織和連接信息的細(xì)胞圖譜。莊小威團(tuán)隊(duì)使用MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization，多路抗錯(cuò)熒光原位雜交）來識(shí)別不同的細(xì)胞類型，并繪制它們?cè)谛∈蟪跫?jí)運(yùn)動(dòng)皮層(MOp)中的空間圖譜。通過整合MERFISH和神經(jīng)逆行標(biāo)記，進(jìn)一步揭示了不同類型細(xì)胞的投射模式的復(fù)雜性。

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1.1 MERFISH成像及細(xì)胞聚類分析

作者選擇了258個(gè)標(biāo)記基因進(jìn)行MERFISH成像，其中包括已知的大腦皮層中主要神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞類型的典型標(biāo)記基因，以及由單細(xì)胞和單核RNA測(cè)序聯(lián)合鑒定的神經(jīng)元簇中差異基因表達(dá)以及互作分析選定的標(biāo)記基因。MERFISH成像后將mRNA分配到單個(gè)細(xì)胞中，258個(gè)基因中有4個(gè)染色“不合格”，在隨后的分析中排除。從MERFISH中得到的單個(gè)細(xì)胞平均基因拷貝數(shù)在其他小鼠中可以重復(fù)，并且與混合RNA-seq測(cè)定的基因表達(dá)水平具有高度的相關(guān)性(圖1)。之后，通過無監(jiān)督的聚類分析的MERFISH衍生的單細(xì)胞表達(dá)譜鑒定了39個(gè)興奮性神經(jīng)元簇，42個(gè)抑制性神經(jīng)元簇和14個(gè)非神經(jīng)元簇(圖2)。

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a,單個(gè)視場(chǎng)的解碼MERFISH圖像，白線為識(shí)別的細(xì)胞。比例尺，20 μm（左）和 5 μm（右）。b，DAPI（左）和poly（A）RNA（右）圖像。

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圖2基于MERFISH的細(xì)胞類型分析，基于共同坐標(biāo)框架的MERFISH圖像配準(zhǔn)和細(xì)胞組成

a，樹狀圖顯示了MERFISH鑒定的39個(gè)谷氨酸能簇、42個(gè)gaba能簇和14個(gè)非神經(jīng)元簇之間的層次關(guān)系。b，用UMAP細(xì)胞類型進(jìn)行分類。c&d，MERFISH 確定的細(xì)胞亞類與scRNA-seq 和snRNA-seq數(shù)據(jù)集確定的細(xì)胞亞類之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。e，MERFISH對(duì)不同細(xì)胞簇染色示意。f，整個(gè)成像區(qū)域以及初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)(MOp)中三個(gè)主要細(xì)胞類別。

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1.2細(xì)胞分布的空間差異

MERFISH 圖像直觀地顯示了在 MOp 及其鄰近區(qū)域細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄差異(圖3 a)。谷氨酸能細(xì)胞簇，特別是IT亞類，在全部分層都有分布(圖3b)。與幾乎跨越整個(gè)皮層的IT細(xì)胞不同，ET、NP、CT和L6b細(xì)胞只分布在較深的分層(圖3 b，c)。個(gè)別的谷氨酸能細(xì)胞簇沿著皮層方向呈現(xiàn)出區(qū)分明顯的、部分重疊的分布，而且這些細(xì)胞簇許多呈現(xiàn)分布寬度小于個(gè)別皮層的厚度。Gaba能神經(jīng)元也表現(xiàn)出高水平的空間多樣性，Lamp5、Sncg和Vip亞類在表層更多，而Sst和Pvalb亞類在深層更多(圖3b，d) 。值得注意的是，在亞群水平，大多數(shù)Gaba能亞群優(yōu)先分布在一個(gè)或兩個(gè)皮質(zhì)層(圖3d)。作者還繪制了非神經(jīng)元細(xì)胞的空間組織(圖3b，e)。在三個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞群中，星形膠質(zhì)細(xì)胞1分布于各層，星形膠質(zhì)細(xì)胞2分布于L1和白質(zhì)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞3幾乎只分布于白質(zhì)中。少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系分為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和3個(gè)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞群，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞在白質(zhì)中富集，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞均勻分布于各層。血管軟腦膜細(xì)胞形成皮層的最外層細(xì)胞。其他類型的非神經(jīng)細(xì)胞在皮質(zhì)層和白質(zhì)中的分布更為分散。

作者注意到不同細(xì)胞種群在空間上大量混合。為了量化每個(gè)細(xì)胞鄰近區(qū)域的細(xì)胞組成的復(fù)雜性，確定了每個(gè)細(xì)胞鄰近區(qū)域存在的不同細(xì)胞簇的數(shù)量，并觀察到高水平的局部細(xì)胞異質(zhì)性，細(xì)胞鄰近區(qū)域的組成復(fù)雜性向深層遞增(圖3f)。

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a，冠狀切片中細(xì)胞群的空間圖。基于Allen圖譜確定的MOp區(qū)域是灰色的。b，相同切片的谷氨酸能(左)、