組織細(xì)胞的空間關(guān)系對細(xì)胞發(fā)育、分化有重要影響。Slide-seq是一種基于原位捕獲的高通量空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，特點是無偏向性、10μm分辨率，其開發(fā)者陳飛團隊以“Dissecting mammalian spermatogenesis using spatial transcriptomics”為題于2021年11月發(fā)表在Cell Reports上，利用空間轉(zhuǎn)錄組圖譜解析精子發(fā)生的表達(dá)動力學(xué)以及糖尿病對精子生成的影響。
精子發(fā)生是精子產(chǎn)生的生物學(xué)過程，精子生成于睪丸的曲細(xì)精管。曲細(xì)精管總共約占睪丸總體積的 60% ～ 80%，它含有生精細(xì)胞、管周細(xì)胞和支持細(xì)胞。精子發(fā)生過程起始于精原干細(xì)胞的分化，終止于成熟的精子形成。不同的精原干細(xì)胞在曲細(xì)精管中按照特殊的細(xì)胞聯(lián)系排列，形成所謂的精子發(fā)生過程。高通量單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)可以捕獲生殖細(xì)胞在每個發(fā)育階段的基因表達(dá)譜的異質(zhì)性，然而scRNA-seq會丟失細(xì)胞所處的空間環(huán)境，未能捕捉到生殖細(xì)胞譜系和體細(xì)胞譜系之間的空間相互作用阻礙了對精子發(fā)生的全面了解。利用Slide-seq數(shù)據(jù)，作者設(shè)計了一個計算框架，可以精確地定位單個曲細(xì)精管中的睪丸細(xì)胞類型，無偏向性地系統(tǒng)識別具有空間模式的基因和基因程序。結(jié)合Slide-seq和靶向原位RNA測序，作者利用空間轉(zhuǎn)錄組圖譜解析精子發(fā)生的表達(dá)動力學(xué)，證明了小鼠和人類睪丸中精原細(xì)胞微環(huán)境的細(xì)胞組成存在顯著差異。最后，對野生型和糖尿病小鼠睪丸的空間圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)曲細(xì)精管的空間細(xì)胞組織破壞是糖尿病誘導(dǎo)雄性不育的潛在機制。
1. 繪制小鼠睪丸的空間細(xì)胞圖譜
作者建立了一個工作流程以將睪丸mRNA捕獲到Slide-seq陣列上（圖 1A和1B）。每個陣列由具有獨特空間條形碼的直徑10 μm珠子組成，對這些條形碼進(jìn)行原位測序，以將每個珠子對應(yīng)到一個獨特的空間位置（圖 1A）。接下來，在冷凍切片期間，將冷凍睪丸薄切片（厚約10 μm）放置在空間索引珠陣列的頂部，并且讓珠子捕獲來自睪丸切片的mRNA。來自條形碼庫的后續(xù)測序數(shù)據(jù)可以唯一匹配到珠陣列上的空間坐標(biāo)（圖 1B）。Slide-seq陣列直徑 (3 mm) 可以完全覆蓋成年小鼠睪丸橫截面。通過此工作流程，可以通常獲得較高mRNA捕獲率，平均每個珠子捕獲784±25個轉(zhuǎn)錄本（特異分子標(biāo)識符UMIs），每個陣列的平均珠數(shù)29333±1514個。
在識別細(xì)胞類型之后，作者將曲細(xì)精管的信息和生精上皮周期的不同階段分配給每個珠子。為此，作者首先進(jìn)行了擬時序分析，以沿著轉(zhuǎn)錄軌跡排列每個珠子。該分析概括了已知的生殖細(xì)胞發(fā)育軌跡（圖 1E）。接下來，作者開發(fā)一個計算流程來對屬于同一曲細(xì)精管的Slide-Seq珠進(jìn)行自動分組（圖1F），并基于擬時序分析來重建曲細(xì)精管圖像，保留了橫截面的形態(tài)細(xì)節(jié)。最后，一個生精周期可以分為幾個亞階段，每個階段都包含不同的生殖細(xì)胞亞型關(guān)聯(lián)。通過將具有已知階段依賴性表達(dá)模式（例如Prm1）的基因表達(dá)譜投影到曲細(xì)精管的 UMAP（統(tǒng)一流形近似和投影）上（圖 1G），將每個精管分配給四個主要階段簇（階段 I-III、IV-VI、VII-VIII 和 IX-XII）之一（圖 1H）。
圖 1 繪制小鼠睪丸空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，本文圖片引用自Chen et al., 2021
(A) Slide-seq微珠寡核苷酸序列示意圖。
(B) 睪丸樣本的Slide-seq工作流程。
(C) 睪丸細(xì)胞類型的空間映射。ES，伸長中/伸長的精細(xì)胞；RS，圓形精子細(xì)胞；SPC，精母細(xì)胞；SPG，精原細(xì)胞。比例尺，300 μm。
(D) 單個睪丸細(xì)胞類型的空間映射。比例尺，300 μm。
(E) 生殖細(xì)胞發(fā)育軌跡的擬時序重建。比例尺，300 μm。
(F) 曲細(xì)精管的數(shù)字分割。比例尺，300 μm。
(G) 曲細(xì)精管在基因表達(dá)空間中的UMAP投影。細(xì)胞簇根據(jù)已知階段特異性表達(dá)模式基因的表達(dá)量來著色。
(H) 四個階段集群的空間映射。比例尺，300 μm。
2. 曲細(xì)精管中 SP 基因的系統(tǒng)鑒定
具有空間非隨機分布的基因可能在不同的細(xì)胞類型或細(xì)胞亞型中發(fā)揮作用。為此，作者使用空間轉(zhuǎn)錄組圖譜在單個曲細(xì)精管水平鑒定空間非隨機分布的基因（以下稱為SP基因）（圖 2A）。在所有SP基因中，57.9% (589)是先前鑒定的廣泛出現(xiàn)在多種類型細(xì)胞的基因。作者使用單分子熒光原位雜交（smFISH）證實了SP基因鑒定的準(zhǔn)確性（圖 2B）。接下來，作者對已識別的SP基因進(jìn)行了基因本體（GO）富集分析。盡管精子細(xì)胞發(fā)育和分化等信號通路在所有階段共享，但作者發(fā)現(xiàn)某些信號通路是階段富集的(圖 2D)。作者通過觀察精細(xì)胞在精子發(fā)生過程中的基因表達(dá)譜，并根據(jù)它們所屬的階段對它們進(jìn)行排序（圖 2E）。作者根據(jù)各個階段細(xì)胞的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，概括出精子發(fā)生過程中組蛋白到精蛋白轉(zhuǎn)變的時間動態(tài)。
圖 2 曲細(xì)精管空間非隨機分布(SP)基因的系統(tǒng)鑒定
(A) 在生精上皮循環(huán)的每個階段，具有先前已知空間模式的基因數(shù)量與使用空間轉(zhuǎn)錄組圖譜新鑒定的基因數(shù)量。
(B)空間轉(zhuǎn)錄組圖譜和單分子熒光原位雜交 (smFISH)揭示了Smcp和Lyar的空間表達(dá)模式。比例尺代表 30 μm 的數(shù)字重建曲細(xì)精管圖像和 50 μm 的 smFISH 圖像。
(C) 空間轉(zhuǎn)錄組圖譜揭示了Tnp1的階段依賴性空間表達(dá)模式。ES，伸長中/伸長的精細(xì)胞；RS，圓形精子細(xì)胞；SPC，精母細(xì)胞；SPG，精原細(xì)胞。
(D)四個階段簇的SP基因的基因本體（GO）富集分析。
(E) 精子發(fā)生過程中核組織中富集的 SP 基因的時間表達(dá)動態(tài)。
(F) 空間轉(zhuǎn)錄組圖譜和 smFISH 揭示了Habp4的階段依賴性空間表達(dá)模式。
(G) Habp4 蛋白與乙酰化組蛋白 4 (Acetyl H4) 在小鼠和人類精子細(xì)胞中的共定位。比例尺代表鼠標(biāo)圖像的 40 μm 和插圖的 10 μm。比例尺，人類圖像為40 μm ，插圖為15 μm。
3. 識別間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的階段特異性表達(dá)模式
作者接下來轉(zhuǎn)向在不同睪丸細(xì)胞類型中具有階段特異性表達(dá)模式的基因。階段特異性基因表達(dá)已被證明是睪丸中生殖細(xì)胞和體細(xì)胞的基本特征。然而，間質(zhì)和管周空間中體細(xì)胞的階段特異性表達(dá)模式在很大程度上仍未明確。為此，作者使用空間轉(zhuǎn)錄組圖譜對間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。作者首先在I-III、IV-VI和VII-VIII 階段簇中分別鑒定了間質(zhì)細(xì)胞的階段特異性基因（圖 3A）。為了進(jìn)一步驗證結(jié)果，作者使用smFISH來確認(rèn)H2bl1在 IV-VI 期相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞中的階段特異性（圖 3B）。有趣的是，作者注意到表達(dá)H2bl1（也稱為1700024P04Rik）的間質(zhì)細(xì)胞優(yōu)先定位在管周間隙附近（圖 3B）。表達(dá)H2bl1的間質(zhì)細(xì)胞的稀疏性和空間定位類似于干間質(zhì)細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)H2bl1可能參與調(diào)節(jié)間質(zhì)干細(xì)胞功能。與對間質(zhì)細(xì)胞的分析類似，對巨噬細(xì)胞群進(jìn)行差異基因表達(dá)分析（圖 3C）。然后作者使用smFISH來確認(rèn)Efcab6的階段特異性表達(dá)模式（圖 3D）。作者通過鑒定階段依賴性基因表達(dá)程序，證明了生精上皮細(xì)胞的循環(huán)如何影響間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分子組成，還根據(jù)空間定位成功區(qū)分了睪丸巨噬細(xì)胞的兩個譜系。
圖 3 間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的階段依賴性基因表達(dá)模式
(A) 左圖：間質(zhì)細(xì)胞空間定位示意圖。右圖：在間質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)出階段依賴性表達(dá)模式的基因。
(B) 上圖：表達(dá)1700017N19Rik的間質(zhì)細(xì)胞（由Cyp11a1標(biāo)記）定位在 IV-VI 期曲細(xì)精管附近，但在其他階段不靠近小管。基底膜由白色虛線勾勒。比例尺，20 μm。下圖：總結(jié)不同階段組曲細(xì)精管附近表達(dá)1700017N19Rik的間質(zhì)細(xì)胞百分比的條形圖。
(C) 左：巨噬細(xì)胞空間定位示意圖。右圖：巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出階段依賴性表達(dá)模式的基因。
(D)上圖：表達(dá)Efcab6的巨噬細(xì)胞（由Adgre1標(biāo)記）定位在 I-III 期曲細(xì)精管附近，但在其他階段不靠近小管。基底膜由白色虛線勾勒。比例尺，20 μm。下圖：條形圖總結(jié)了不同階段組曲細(xì)精管附近表達(dá)Efcab6的巨噬細(xì)胞的百分比。
4. 原位RNA測序分析精原細(xì)胞微環(huán)境的空間
精原細(xì)胞 (SPG) 包含干細(xì)胞群，以往的研究表明，SPG的自我更新和分化受其周圍微環(huán)境的影響。為了系統(tǒng)地分析精原細(xì)胞微環(huán)境，作者首先在空間上繪制了小鼠(圖 4A)和人類(圖 4E)睪丸中未分化和分化 SPG 的種群。令人驚訝的是，與小鼠相比，作者發(fā)現(xiàn)人類未分化和分化SPGs周圍微環(huán)境的空間細(xì)胞組成存在顯著差異（圖 4F）。對于睪丸間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等體細(xì)胞類型尤其如此，但對于支持細(xì)胞和肌樣細(xì)胞則不然，這表明在人類睪丸中這些體細(xì)胞類型之間在塑造精原細(xì)胞微環(huán)境方面可能存在不同的作用。最后，作者使用多重smFISH證實了這一發(fā)現(xiàn)，顯示了人類未分化和分化SPG周圍微環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的差異富集(圖 4G）。作者的數(shù)據(jù)揭示了小鼠和人類精原細(xì)胞微環(huán)境空間結(jié)構(gòu)的顯著差異，表明兩種物種在精子發(fā)生的早期階段存在不同的調(diào)控機制。
圖 4 小鼠與人類睪丸中的差異干細(xì)胞微環(huán)境
(A)使用 Slide-seq 數(shù)據(jù)對小鼠未分化和分化精原細(xì)胞進(jìn)行空間映射。比例尺，300 μm。
(B) K 最近鄰 (KNN) 方法，使用 Slide-seq 數(shù)據(jù)計算每個小鼠精原細(xì)胞周圍微環(huán)境中的細(xì)胞類型組成。此處顯示了未分化精原細(xì)胞與具有 K = 5 個鄰居的分化精原細(xì)胞周圍微環(huán)境的細(xì)胞類型組成的比較。顯示 K = 10 和 15 的圖顯示在圖 S5B中。圖 S5C中顯示了兩個額外的生物學(xué)重復(fù)。ns，不顯著；ES，伸長中/伸長的精細(xì)胞；RS，圓形精子細(xì)胞；SPC，精母細(xì)胞；Diff SPG，區(qū)分精原細(xì)胞；Undiff SPG，未分化的精原細(xì)胞。
(C)針對 22 個基因的小鼠睪丸樣本的原位測序。ES，伸長中/伸長的精細(xì)胞；RS，圓形精子細(xì)胞；Diff SPG，區(qū)分精原細(xì)胞；Undiff SPG，未分化的精原細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞。白色虛線勾勒出圖像中的曲細(xì)精管。比例尺代表 20 μm（插圖為 2 μm）。
(D)使用 (C) 中生成的數(shù)據(jù)計算未分化小鼠與分化精原細(xì)胞周圍微環(huán)境的細(xì)胞類型組成的 KNN。使用了 K = 5 個鄰居。顯示 K = 10 和 15 的圖顯示在圖 S5E中。ns，不顯著；ES，伸長中/伸長的精細(xì)胞；RS，圓形精子細(xì)胞；SPC，精母細(xì)胞；Diff SPG，區(qū)分精原細(xì)胞；Undiff SPG，未分化的精原細(xì)胞。
(E)使用 Slide-seq 數(shù)據(jù)對人類未分化和分化精原細(xì)胞進(jìn)行空間映射。比例尺，300 μm。
(F)人類未分化與分化精原細(xì)胞周圍微環(huán)境的細(xì)胞類型組成的比較。使用了 K = 10 個鄰居。
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