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這篇文章探討了益生菌及其代謝產(chǎn)物亞精胺(Spermidine, SPD)如何增強(qiáng)IFN-γ⁺CD4⁺T細(xì)胞免疫反應(yīng)以抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)。全球約有2.96億人慢性感染HBV，這增加了肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，使HBV成為最嚴(yán)重的傳染病之一。世界衛(wèi)生組織的目標(biāo)是到2030年將HBV發(fā)病率減少95%，死亡率減少65%。理想的HBV抗病毒治療目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)功能性治愈，即持續(xù)抑制HBV DNA并使血清乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface Antigen, HBsAg)消失。然而，實(shí)現(xiàn)慢性HBV感染的功能性治愈是困難的，自然歷史成功率不到1%，即使長(zhǎng)期治療，現(xiàn)有抗病毒藥物的成功率也不到5%。因此，恢復(fù)T細(xì)胞免疫和實(shí)現(xiàn)HBV感染的功能性治愈是研究的重點(diǎn)。

在5周齡的C57BL/6小鼠體內(nèi)通過水動(dòng)力注射(Hydrodynamical Injection, HDI)腺相關(guān)病毒/HBV1.2(AAV/HBV1.2)質(zhì)粒制備了HBV攜帶者小鼠模型，從HDI前2周（BLE Pre組）或注射后3天（BLE組）開始，每天灌胃BLE（圖1A）。如圖1B-E所示，BLE和BLE Pre均能顯著抑制HBV復(fù)制，表現(xiàn)為血清HBsAg、HBV DNA以及肝臟前基因組RNA(pgRNA)和HBV RNA水平降低。與此一致的是，在注射后6周內(nèi)，給藥BLE顯著降低HBsAg陽性小鼠的百分比(wpi)（圖1F）。

通過16S rRNA測(cè)序，研究者發(fā)現(xiàn)益生菌處理的小鼠腸道微生物組發(fā)生了顯著變化，包括Prevotellaceae、Clostridiaceae、Akkermansia和Ruminococcaceae等家族的富集（圖2C），這些家族被認(rèn)為有助于通過抗PD-1或CTLA-4抗體恢復(fù)耗盡的CD8⁺T細(xì)胞。此外，益生菌處理的小鼠糞便中BLE（B. longum, L. acidophilus, 和E. faecalis）的豐度顯著增加（圖2D），表明益生菌在腸道中的積累。

收集PBS或BLE處理的HBV攜帶小鼠（供體小鼠）的糞便。使用受體小鼠進(jìn)行FMT實(shí)驗(yàn)，在5周齡時(shí)，用抗生素混合物(ABX)治療14天，然后用HBV HDI對(duì)其進(jìn)行腸道消毒（圖2E）。如圖2F-2H所示，移植BLE小鼠糞便微生物群(FMT-BLE)可顯著促進(jìn)受體小鼠對(duì)HBV的清除，與接受對(duì)照糞便微生物群(FMT-Control)的小鼠相比，血清HBsAg和HBV DNA水平明顯降低，肝臟pgRNA表達(dá)明顯降低。同樣，F(xiàn)MT-BLE小鼠中HBsAg陽性小鼠的百分比明顯低于FMT-Control小鼠（圖2I）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BLE在HBV清除中的直接作用，引入無菌(GF)小鼠，通過HDI建立HBV模型，然后給予益生菌（圖2J）。與無特定病原體(SPF)小鼠的結(jié)果一致，添加BLE大大增加了GF小鼠糞便中BLE的數(shù)量（圖2K），降低了血清HBsAg、HBV DNA和肝臟pgRNA的水平（圖2L）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明BLE的積累有助于小鼠的HBV清除。

進(jìn)一步探究CD4⁺T細(xì)胞亞群在BLE介導(dǎo)的HBV清除中的作用（圖3D-L），RT-qPCR與FCM檢測(cè)顯示，BLE處理使小鼠肝臟Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，(T-bet)⁺Th1細(xì)胞增多。ELISA和FCM分析表明，肝臟勻漿IL-21、IFN-γ水平，以及Th1細(xì)胞中二者表達(dá)顯著增加。此外，BLE處理提升了脾臟CD8⁺T細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)量，增加無菌小鼠肝臟和脾臟IFN-γ⁺CD4⁺T細(xì)胞數(shù)量。上述結(jié)果表明，給予BLE能夠使宿主通過增強(qiáng)CD4⁺Th1細(xì)胞中IL-21和IFN-γ的產(chǎn)生來清除HBV。

研究者發(fā)現(xiàn)，益生菌影響宿主的微生物代謝。通過飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(GC-TOF-MS)檢測(cè)了BLE處理小鼠糞便中的代謝物變化。結(jié)果顯示，38種代謝物在對(duì)照組和BLE處理組小鼠之間存在顯著差異，其中包括亞精胺(SPD)（圖4A)。進(jìn)一步的靶向代謝組學(xué)分析表明，SPD在BLE處理的小鼠肝臟中積累，并且其濃度高于腐胺(putrescine)。重要的是，亞精胺在BLE處理的GF小鼠的糞便、外周血清和肝臟中積累（圖4B），表明BLE產(chǎn)生的亞精胺可能通過血液循環(huán)從腸道轉(zhuǎn)移到肝臟。

采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法獲得培養(yǎng)上清并檢測(cè)SPD濃度。發(fā)現(xiàn)在含精氨酸的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)的BLE在pH 5.0時(shí)產(chǎn)生的SPD水平明顯高于pH7.0（圖4C）。此外，給藥BLE在抗生素(ABX)處理小鼠的糞便、肝組織和血清中產(chǎn)生的SPD水平明顯較高，而單獨(dú)的糞腸桿菌在體外和體內(nèi)都不能有效產(chǎn)生SPD（圖4C）。因此，BLE能有效地產(chǎn)生SPD并增強(qiáng)抗HBV免疫，糞腸桿菌能在長(zhǎng)芽胞桿菌和嗜酸乳桿菌的協(xié)同下產(chǎn)生SPD。

進(jìn)一步研究SPD在HBV清除中的作用。發(fā)現(xiàn)SPD單獨(dú)給藥可顯著降低HBV攜帶者小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝臟pgRNA水平（圖4D-4F）。綜上所述，這些結(jié)果表明，BLE來源的SPD通過外周循環(huán)從腸道積累到肝臟，這有助于小鼠的HBV清除。

研究者進(jìn)一步探索了SPD介導(dǎo)的HBV清除背后的機(jī)制，包括腸道穩(wěn)態(tài)和T細(xì)胞免疫。結(jié)果顯示，亞精胺喂養(yǎng)的小鼠顯示出腸道緊密連接蛋白表達(dá)的顯著增加，伴隨著血清FITC-葡聚糖和iFABP水平的明顯降低。此外，SPD喂養(yǎng)導(dǎo)致腸道IL-17A、IL-21和IL-22表達(dá)的顯著增加，以及腸道IL-17A⁺CD4⁺T細(xì)胞、IL-21⁺CD4⁺T細(xì)胞和IL-22⁺CD4⁺T細(xì)胞的百分比和MFI的增加。亞精胺還增強(qiáng)了HBV攜帶小鼠肝臟和脾臟中IL-21⁺CD4⁺T細(xì)胞和IFN-γ⁺CD4⁺T細(xì)胞的頻率（圖4G和4H），ELISA證實(shí)SPD小鼠肝臟勻漿中IL-21和IFN-γ水平顯著升高（圖4I），提示SPD增強(qiáng)了HBV攜帶者小鼠的CD4⁺T細(xì)胞免疫。

用有或沒有SPD的ovabumin(OVA323-339)肽刺激OT-II小鼠的體外脾細(xì)胞。FCM證實(shí)SPD以劑量依賴性方式增強(qiáng)ova刺激的OT-II CD4⁺T細(xì)胞中IFN-g的產(chǎn)生（圖5A）。同時(shí)，SPD劑量依賴性地促進(jìn)了OT-II CD4⁺T細(xì)胞中自噬體的積累（圖5B），而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA, 1 mM)進(jìn)一步增強(qiáng)了SPD誘導(dǎo)的自噬體積累（SPD+3-MA，圖5C），提示SPD處理的CD4⁺T細(xì)胞中自噬活化。值得注意的是，3-MA顯著降低SPD誘導(dǎo)的CD4⁺T細(xì)胞中IFN-g的增加（圖5D）。

SPD是真核翻譯起始因子5A(eIF5A)的唯一已知底物，elf5a通過選擇性翻譯調(diào)控tfeb蛋白表達(dá)。用GC7(SPD+GC7)（eIF5A的特異性抑制劑）處理，減少了SPD誘導(dǎo)的自噬體的積累（圖5C），并完全破壞了SPD誘導(dǎo)的IFN-γ在CD4⁺T細(xì)胞中的積累（圖5D）。與此一致的是，SPD誘導(dǎo)HBV攜帶者小鼠肝臟CD4⁺T細(xì)胞中的自噬體積累（圖5E）。更重要的是，SPD顯著促進(jìn)了來自HBV患者外周血的CD4⁺T細(xì)胞中自噬體和IFN-γ的積累，而GC7的治療在很大程度上破壞了這種誘導(dǎo)（圖5F和5G）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明SPD以自噬依賴的方式增強(qiáng)CD4⁺T細(xì)胞的功能。

為了評(píng)估益生菌在自然微生物組中是否會(huì)引起類似的改變，并評(píng)估BLE和亞精胺在HBV清除中的臨床治療潛力，研究者通過用HBV患者的糞便樣本重建GF小鼠的微生物群，構(gòu)建了人類菌群相關(guān)(HFA)小鼠模型。結(jié)果顯示，BLE和SPD在HFA小鼠中顯示出顯著的HBV清除能力。與對(duì)照組相比，BLE/亞精胺處理的HFA小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝內(nèi)pgRNA水平顯著降低（圖6B-D）。BLE和亞精胺顯著促進(jìn)了肝內(nèi)CD4⁺T細(xì)胞中自噬體的積累（圖6E），并增強(qiáng)了肝臟和脾臟CD4⁺T細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生（圖6F）。更重要的是，BLE和SPD都顯著增強(qiáng)了肝臟和脾臟HBV特異性CD4⁺T細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生，表明BLE和SPD對(duì)HBV特異性免疫的潛在貢獻(xiàn)（圖6G）。

對(duì)血清HBsAg持續(xù)低水平（低于2000 IU/mL）的HBV患者進(jìn)行BLE聯(lián)合抗病毒治療的臨床效果進(jìn)行了初步觀察，這些患者通常被認(rèn)為是功能治愈的有利人群趨勢(shì)(圖6h)。與對(duì)照組相比，接受BLE治療6個(gè)月的患者血清HBsAg和HBeAg明顯下降（圖6I）。正如預(yù)期的那樣，補(bǔ)充BLE顯著促進(jìn)外周血單核細(xì)胞(PBMCs)CD4⁺T細(xì)胞中自噬體的積累和IFN-γ的表達(dá)（圖6J和6K）。

基于SPD在T細(xì)胞激活和HBV清除中的作用，研究者進(jìn)一步確定亞精胺是否能夠增強(qiáng)恩替卡韋(ETV)的治療效果。結(jié)果顯示，與ETV單藥治療相比，ETV和亞精胺的聯(lián)合治療組在HBsAg和pgRNA水平上顯示出更顯著地降低，同時(shí)對(duì)HBV DNA的抑制效果與單藥治療相當(dāng)（圖7A-D）。

這項(xiàng)研究表明，益生菌和其代謝產(chǎn)物亞精胺通過自噬增強(qiáng)IFN-γ⁺CD4⁺T細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效促進(jìn)HBV的清除。這些發(fā)現(xiàn)為使用益生菌和亞精胺與抗HBV藥物聯(lián)合治療慢性HBV感染提供了可能的治療線索。盡管這項(xiàng)研究在人類中的樣本量較小，但數(shù)據(jù)仍然顯示了益生菌在實(shí)現(xiàn)HBV功能性治愈方面的潛力。未來的研究需要通過前瞻性隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來驗(yàn)證這些初步觀察結(jié)果，并進(jìn)一步探索益生菌和亞精胺在HBV治療中的作用機(jī)制。