題目：Genome organization and chromatin analysis identify transcriptional downregulation of insulin-like growth factor signaling as a hallmark of aging in developing B cells
通過基因組組織和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析確定了胰島素樣生長因子信號的轉(zhuǎn)錄下調(diào)是B細(xì)胞開始衰老的標(biāo)志
期刊：Genome Biology
影響因子：13.214
研究背景
衰老的特征是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能的喪失，但其根本原因卻鮮為人知。為了評估年齡對B細(xì)胞發(fā)育的影響，作者對組蛋白修飾和染色體構(gòu)象相關(guān)的基因表達(dá)和染色質(zhì)特征進(jìn)行了分析，使用的實(shí)驗材料來自不同年齡階段的小鼠的pro-B和pre-B細(xì)胞。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. 在衰老過程中，平均pro-B和 pre-B細(xì)胞數(shù)量分析
使用多參數(shù)流式細(xì)胞分析小鼠骨髓B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)老年小鼠的pre-B細(xì)胞發(fā)生實(shí)質(zhì)性的變化(圖1)，老年的(三個月)與年輕的老鼠(約19 - 22日)相比，pro-B細(xì)胞大約減少了兩個(圖1 c)、pre-B細(xì)胞卻有著近兩倍數(shù)量的減少(圖1 d)，該結(jié)果與先前的報道一致。與此相反的是，發(fā)現(xiàn)在老年小鼠骨髓中會重新循環(huán)成熟的B細(xì)胞（圖1e），不能排除被分類的衰老pro-B細(xì)胞群體中存在少量成熟B細(xì)胞污染。可能是由于成熟B細(xì)胞再循環(huán)數(shù)量增加，以及在衰老的骨髓中，B細(xì)胞前體(IgM-)和成熟細(xì)胞(IgM+)分離不那么明顯。
圖1 衰老小鼠B細(xì)胞前體基因表達(dá)變化
2. pro-B和pre-B 細(xì)胞中的基因表達(dá)分析
對核糖體RNA (rRNA)耗盡的總RNA轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，衰老pro-B細(xì)胞中有82個顯著上調(diào)和54個下調(diào)基因，衰老pre-B細(xì)胞中有23個上調(diào)和33個下調(diào)基因（圖2 a , b）。pro-B細(xì)胞和pre-B細(xì)胞之間的年齡特異性表達(dá)變化是相關(guān)的，即使只有一種細(xì)胞類型也能達(dá)到顯著性（圖2 c）。在pro-B和pre-B細(xì)胞階段的老化過程中，一些基因被降低了，這些基因編碼胰島素樣生長因子（IGF）信號傳導(dǎo)途徑的組成部分，如IRS1和IGF1r。IRS1是通路的一個關(guān)鍵組成部分，被發(fā)現(xiàn)其是衰老pre-B細(xì)胞信使RNA (mRNA)水平上最顯著的下調(diào)基因。因此，作者研究了IRS1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)在pro-B細(xì)胞和pre-B細(xì)胞的老化過程中，蛋白含量都有所下降，這表明IRS1介導(dǎo)的特定年齡mRNA變化會降低蛋白質(zhì)水平（圖2d）。對于衰老前B細(xì)胞中下調(diào)的基因，在32個啟動子中，有19個啟動子的活性啟動子或活性調(diào)控區(qū)域狀態(tài)被降低。與大多數(shù)上調(diào)基因的觀察結(jié)果相似，這些變化大多是細(xì)微的，與這些基因表達(dá)中相對較小的折疊變化相一致(圖2b)。
圖2 基因表達(dá)在pro-B和pre-B 細(xì)胞隨著年齡的老化而改變
3. 初期的pro-B 和pre-B細(xì)胞的RNA和microrna表達(dá)分析
總RNA水平既反映了轉(zhuǎn)錄速率，也反映了RNA穩(wěn)定性等下游過程。為了更直接地探討衰老對基因轉(zhuǎn)錄的影響，作者從年輕和衰老的pro-B細(xì)胞中分離出核RNA，以豐富新生轉(zhuǎn)錄本，并以內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的整體變化作為新生轉(zhuǎn)錄的一種具體衡量指標(biāo)。同時，在總RNA中檢測到17%(175個中有30個)的DEGs在核RNA測序(RNA-seq)分析中也是DEGs，并且整體的折疊變化是相關(guān)的，從而可以認(rèn)為更多的基因存在與年齡相關(guān)的顯著性差異轉(zhuǎn)錄（圖3a）。值得注意的是，一些年齡下調(diào)基因，如Plxdc2、Igf1、Igf2bp3和Igf1r，以及上調(diào)的基因，如Adam19和Tmem163，都與IGF信號或2型糖尿病有關(guān)。更廣泛地說，DEGs的KEGG 通路分析突出了幾個與營養(yǎng)信號相關(guān)的代謝通路。
通過核RNA-seq分析顯示Nespas是衰老pro-B細(xì)胞中最顯著的下調(diào)基因之一（圖3a）。Nespas是非編碼轉(zhuǎn)錄本，參與調(diào)控印跡，是miRNAs miR-296和miR-298的非編碼前體RNA。為了探索B細(xì)胞前體中miRNA表達(dá)與衰老的關(guān)系，作者進(jìn)行了小RNA-seq，在pro-B細(xì)胞和pre-B細(xì)胞中鑒定出34個有差異顯著的mirna（圖3b、c）。其中20.6%在pro-B細(xì)胞和pre-B細(xì)胞中均表現(xiàn)出表達(dá)差異。該分析證實(shí)了miR-296和miR-298的顯著下調(diào)，與新生RNA-seq檢測到的Nespas水平變化一致。作者還觀察到7個Let-7家族基因和miR-223在pro-B和pre-B細(xì)胞衰老時上調(diào)(圖3b, c)。不同表達(dá)的microrna在衰老過程中被分離成簇，表達(dá)變化相似，并且其中一些表達(dá)在pro-B細(xì)胞和pre-B細(xì)胞之間也有調(diào)節(jié)作用(圖3c)。
Let-7 mirna由12個具有相同序列的成員組成，分別從基因組位點(diǎn)Let-7a1、Let-7a2、Let-7b、Let -7c、Let -7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f1、Let-7f2、Let-7g、Let-7i和miR-98進(jìn)行表達(dá)。Let-7b和7 c在年老的pre-B細(xì)胞顯著上調(diào)microrna，作者檢查了核RNA-seq數(shù)據(jù)，年老的pro-B細(xì)胞非編碼RNA 在15號染色體上顯著增加。因此推測，這個轉(zhuǎn)錄組可能是這些microrna的RNA前體。
圖3 初期的pro-B和pre-B細(xì)胞的RNA和microrna表達(dá)隨著年齡的老化而改變
4. 染色質(zhì)可及性和pre-B細(xì)胞中的H3K27me3與年齡相關(guān)的變化分析
在老年pre-B細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)10個可及性明顯較低的區(qū)域和4個可及性較高的區(qū)域(圖4a)。可及性低的兩個區(qū)域與Irs1啟動子區(qū)域重疊，另一個區(qū)域與Irs1轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)接近(
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