IF=6.2！首醫(yī)大牛丕業(yè)教授團(tuán)隊(duì)破譯錳神經(jīng)毒性?shī)W秘：鐵死亡通路成關(guān)鍵“突破口”

英文標(biāo)題：Multi-omics analysis reveals Mn exposure affects ferroptosis pathway in zebrafish brain

中文標(biāo)題：多組學(xué)分析揭示錳暴露對(duì)斑馬魚(yú)大腦鐵死亡途徑的影響

發(fā)表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

影響因子：6.1

客戶(hù)單位：首都醫(yī)科大學(xué)

百趣提供服務(wù)：新一代代謝組學(xué)NGM 2 Pro
 

研究背景

錳(Mn)是人體必需的微量元素，同時(shí)也是一種廣泛存在的職業(yè)性毒物和環(huán)境污染物。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中過(guò)量的Mn積累會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，毒理學(xué)研究已證實(shí)，Mn可引發(fā)多種不良效應(yīng)，包括發(fā)育毒性、心血管毒性、肝毒性、腎毒性及免疫毒性等。其中，Mn的神經(jīng)毒性尤為受關(guān)注，因其可穿過(guò)血腦屏障并在腦內(nèi)蓄積。既往研究表明，Mn誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的部分機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、代謝異常、神經(jīng)炎癥及細(xì)胞凋亡等，但由于大腦細(xì)胞存在組成復(fù)雜性和異質(zhì)性，在單細(xì)胞水平上對(duì)Mn誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的分子機(jī)制研究仍較為有限。本研究采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)(scRNA-seq)篩選出斑馬魚(yú)大腦中在Mn暴露下受影響顯著且在神經(jīng)毒性過(guò)程中起關(guān)鍵作用的神經(jīng)元類(lèi)型，并結(jié)合基因表達(dá)譜和非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究Mn對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)毒性的機(jī)制。
 

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研究結(jié)果

1、錳暴露后斑馬魚(yú)腦單細(xì)胞圖譜的構(gòu)建

為了更好地了解Mn暴露對(duì)斑馬魚(yú)腦中不同細(xì)胞類(lèi)型的影響，研究者繪制了斑馬魚(yú)大腦在不同Mn暴露水平（對(duì)照組、低暴露組、高暴露組）下的單細(xì)胞圖譜。通過(guò)分析共鑒定了21個(gè)細(xì)胞簇（圖1A），并通過(guò)標(biāo)記基因鑒定了10種細(xì)胞類(lèi)型：膽堿能神經(jīng)元、DA神經(jīng)元（多巴胺能神經(jīng)元）、谷氨酸能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、神經(jīng)元前體、其他神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、放射狀膠質(zhì)細(xì)胞和未定義細(xì)胞。圖1C可視化了每個(gè)細(xì)胞簇中標(biāo)記基因的表達(dá)情況，圖1D顯示了各組中細(xì)胞類(lèi)型的占比情況。與對(duì)照組相比，低暴露組中膽堿能神經(jīng)元的比例增加0.347%，但在高暴露組中減少了3.405%；DA神經(jīng)元在低暴露組中增加了0.251%，但在高暴露組中減少了1.186%；GAB能神經(jīng)元在低暴露組和高暴露組中分別顯著增加了4.449%和3.373%。這些結(jié)果表明，Mn暴露可以改變膽堿能神經(jīng)元、DA神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元的細(xì)胞類(lèi)型比例。

圖1. 斑馬魚(yú)腦的單細(xì)胞圖譜

2、錳暴露對(duì)斑馬魚(yú)腦神經(jīng)元類(lèi)型分化軌跡的影響

神經(jīng)元是大腦接收、整合、傳導(dǎo)和傳遞信息的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。因此，研究者對(duì)不同亞型的神經(jīng)元進(jìn)行了進(jìn)一步分析，獲得了12個(gè)并列的細(xì)胞簇（圖2A）。值得注意的是，膽堿能神經(jīng)元、DA神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元這四種主要神經(jīng)元類(lèi)型，在這些亞簇中呈現(xiàn)獨(dú)立的分布模式。通過(guò)擬時(shí)序分析將不同表達(dá)水平的基因按軌跡進(jìn)行排序，結(jié)果顯示，隨著Mn暴露劑量的增加，神經(jīng)元逐漸趨向軌跡的末端，這在一定程度上驗(yàn)證了所構(gòu)建軌跡的合理性。

進(jìn)一步將擬時(shí)序分析結(jié)果與細(xì)胞類(lèi)型結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中以DA神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元為主導(dǎo)，而Mn暴露后，神經(jīng)元類(lèi)型的主導(dǎo)模式呈現(xiàn)明顯動(dòng)態(tài)變化，依次轉(zhuǎn)變?yōu)橐訥ABA能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元和未定義的中間態(tài)神經(jīng)元為主導(dǎo)。

基于擬時(shí)序分析，將表達(dá)水平發(fā)生顯著變化的基因劃分為三個(gè)功能模塊（圖2C）。下調(diào)基因主要富集于核糖核蛋白復(fù)合體生物合成、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞代謝過(guò)程、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路及對(duì)溫度刺激的響應(yīng)等過(guò)程，其中281個(gè)下調(diào)基因與細(xì)胞代謝功能密切相關(guān)（簇1）；上調(diào)基因模塊（簇2）顯著富集于ATP代謝過(guò)程、大分子生物合成調(diào)控、G蛋白偶聯(lián)受體活性、晝夜節(jié)律調(diào)控及電子傳遞鏈相關(guān)通路；簇3的模塊代表基因表達(dá)變化的中間狀態(tài)，可能反映神經(jīng)元類(lèi)型轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)過(guò)程。綜上結(jié)果表明，Mn暴露不僅促使神經(jīng)元類(lèi)型主導(dǎo)模式從DA神經(jīng)元向GABA能神經(jīng)元轉(zhuǎn)變，還動(dòng)態(tài)調(diào)控了與細(xì)胞代謝相關(guān)的基因表達(dá)程序，進(jìn)而影響神經(jīng)元的功能狀態(tài)。

圖2. 聚類(lèi)和擬時(shí)序分析識(shí)別斑馬魚(yú)腦神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)變化

3、多組學(xué)聯(lián)合分析錳對(duì)斑馬魚(yú)腦神經(jīng)元鐵死亡信號(hào)通路的破壞作用

為了探討錳神經(jīng)毒性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和代謝組學(xué)途徑，研究首先對(duì)Mn暴露后神經(jīng)元中的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行了鑒定分析。在低暴露組中，谷氨酸能神經(jīng)元中有289個(gè)DEGs，DA神經(jīng)元中有170個(gè)，GABA能神經(jīng)元中有49個(gè)，膽堿能神經(jīng)元中有27個(gè)（圖3A）。在高暴露組中，所有類(lèi)型的細(xì)胞中觀察到更多的DEGs，其中多巴胺神經(jīng)元中有413個(gè)DEGs，谷氨酸能神經(jīng)元中有141個(gè)，GABA能神經(jīng)元中有107個(gè)，膽堿能神經(jīng)元中有66個(gè)（圖3B）。

采用非靶標(biāo)代謝組學(xué)鑒定代謝物變化（圖3C-D），在低暴露組中檢測(cè)到66個(gè)差異代謝物(DEMs)，在高暴露組中檢測(cè)到63個(gè)DEMs（圖3E-F）。

圖3. 錳暴露后斑馬魚(yú)腦的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化與代謝重編程

由于Mn暴露顯著影響神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組和代謝組，研究者進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)元中DEGs和DEMs富集的代謝通路進(jìn)行了聯(lián)合分析（圖4A-B）。代謝途徑表明，Mn對(duì)細(xì)胞代謝途徑的影響隨Mn劑量的增加而顯著改變。在低暴露和高暴露組中，甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、谷胱甘肽代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝在多種細(xì)胞類(lèi)型中富集。Mn影響參與脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和葡萄糖代謝途徑的代謝物水平，特別是在DA神經(jīng)元中。通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析進(jìn)一步探索Mn暴露后神經(jīng)元代謝通路涉及的信號(hào)通路。結(jié)果顯示，在高暴露組中，膽堿能神經(jīng)元有62條富集通路， GABA能神經(jīng)元有43條富集通路。在高暴露組中富集的134條DA神經(jīng)元通路中，發(fā)現(xiàn)鐵死亡通路包含12個(gè)DEGs和3個(gè)DEMs（圖4C）。在低暴露組中，鐵死亡通路中也有7個(gè)DEGs和3個(gè)DEMs富集。谷氨酸和GSSG的水平隨著Mn暴露劑量的增加而增加，而GSH則呈劑量依賴(lài)性下降趨勢(shì)。在DA神經(jīng)元中，基因hmox1b的表達(dá)在Mn暴露后顯著升高。與此同時(shí)，gpx4a、slc40a1和sat1a.2的表達(dá)與Mn濃度成反比下降。此外，acsl2、gclc、slc3a2b、ncoa4和map1lc3cl的表達(dá)僅在高暴露組中顯著下降。同時(shí)，在其他神經(jīng)元中，沒(méi)有觀察到Mn暴露后鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的顯著差異。

圖4. 多組學(xué)聯(lián)合分析錳對(duì)斑馬魚(yú)腦神經(jīng)元鐵死亡信號(hào)通路的影響

研究結(jié)論

該研究構(gòu)建了成年斑馬魚(yú)慢性Mn暴露模型，繪制了斑馬魚(yú)腦單細(xì)胞圖譜，并在單細(xì)胞水平上研究了Mn暴露后斑馬魚(yú)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。非靶標(biāo)代謝組學(xué)的結(jié)果揭示了Mn暴露下斑馬魚(yú)腦的代謝重編程。本文通過(guò)多組學(xué)的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)Mn暴露破壞了斑馬魚(yú)DA神經(jīng)元中的鐵死亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而揭示了鐵死亡途徑是Mn致神經(jīng)毒性的新型潛在機(jī)制。

新一代代謝組學(xué)NGM 2 Pro：憑借全球領(lǐng)先的2w+代謝物標(biāo)準(zhǔn)品自建庫(kù)，顯著改善代謝組學(xué)鑒定準(zhǔn)確性不足、數(shù)量有限的痛點(diǎn)。其基于LC-MS技術(shù)，可檢測(cè)生物受刺激后小分子代謝物動(dòng)態(tài)變化，助力篩選差異代謝物并關(guān)聯(lián)生理病理。針對(duì)代謝物多樣性及提取局限，該技術(shù)通過(guò)多色譜柱聯(lián)用覆蓋非極性/極性代謝物與脂質(zhì)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品自建庫(kù)進(jìn)一步提升鑒定效率，為標(biāo)志物篩選、機(jī)制研究提供有力支撐。

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END

劉華岐 撰文

Tang 校稿