本期解讀
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題目：Quantitativeproteomic analysis reveals that serine/threonine kinase is involvedin Streptococcus suis virulence and adaption to stress conditions 期刊：Archives of Microbiology 影響因子：1.884 合作技術(shù)：iTRAQ定量蛋白組學(xué)
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豬鏈球菌（S.suis）是一種主要的豬病原體，可引起多種疾病。此外，豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原體。豬鏈球菌血清型2 (SS2)是毒性最強(qiáng)且最常從患病豬中分離的血清型，最常與人類感染有關(guān)。豬鏈球菌血清型2 (SS2)的真核型絲氨酸/蘇氨酸激酶在細(xì)菌發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。在本研究中，用iTRAQ定量蛋白組學(xué)分析不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，特別是那些與細(xì)菌病原體有關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，在野生-型(WT) 菌株SS2-1 及其SsSTK突變菌株，目的是揭示參與適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境和豬鏈球菌毒力的蛋白質(zhì)。
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1、SsSTK突變株和WT株的比較蛋白質(zhì)組分析
iTRAQ定量蛋白組學(xué)共鑒定了來自WT 菌株SS2-1 及其突變菌株Δstk 的1120種蛋白質(zhì)。其中，與WT菌株SS2-1相比，Δstk中281種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平存在顯著差異（>1.5倍變化或<0.67倍變化，P值<0.05），其中134種下調(diào)和147種上調(diào)。
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2、DEPs的功能分類注釋分析
為了深入了解281 種差異表達(dá)蛋白(DEP)的功能類別，進(jìn)行了GO分析以生成基于生物過程和分子功能的分類簇（圖1）。
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Fig.1 GO enrichment analysis of differently expressed proteins in Δstk.Results are grouped by biological process (a) and molecular function(b)
3、DEPs的KEGG通路分析
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為了揭示SsSTK 在SS2 中的作用，進(jìn)行了KEGG 通路分析（圖2）。DEPs主要參與代謝途徑、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成和不同環(huán)境中的微生物代謝。一般來說，這些DEPs中的大部分都參與了關(guān)鍵的代謝和途徑，這可能有助于SS2 的致病性。
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Fig. 2 KEGG pathway enrichmentsin DEPs in Δstk. a Up-regulated and b down-regulated proteins
4、SsSTK 調(diào)節(jié)已知毒力因子
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SsSTK 缺失顯著降低了SS2毒力。在281種DEPs中，VFDB預(yù)測(cè)的毒力因子（VFs）有69種，其中Δstk中有38種下調(diào)蛋白（表1）和31種上調(diào)蛋白（表2），其中26種是SS2的已知VFs。
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5、相互作用網(wǎng)絡(luò)分析證實(shí)了新發(fā)現(xiàn)的 DEP 在已知毒力因子系統(tǒng)中的作用
為了進(jìn)一步了解這些新發(fā)現(xiàn)的DEP在毒力中的作用，作者可視化了由SS2 的已知VF 和VFDB 使用Cytoscape軟件預(yù)測(cè)的新識(shí)別VF 形成的網(wǎng)絡(luò)。36種新發(fā)現(xiàn)的DEP（黃色節(jié)點(diǎn)）參與并補(bǔ)充了毒力相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中一些在連接已知VF（綠色節(jié)點(diǎn)和紅色節(jié)點(diǎn)）并形成重要的樞紐蛋白方面發(fā)揮重要作用。總體而言，結(jié)果表明，69種新型DEP 中有37種參與已知毒力網(wǎng)絡(luò)，并可能在毒力中發(fā)揮作用（圖3）。
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Fig.3 Interaction networks ofdifferentially expressed proteins predicted by the VFDB created usingCytoscape. Protein–protein interactions of differentially expressedproteins of S.suis that had a confidence score?≥?0.4 werevisualized. The lines represent the interactions that exist betweenproteins
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6、通過蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果
選擇上調(diào)的VF DnaJ(41kD) 和下調(diào)的VF OppA(66kD) 來確認(rèn)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。EF-Tu蛋白被用作內(nèi)部參考，因?yàn)樗呢S度在兩組中相對(duì)恒定。蛋白質(zhì)組學(xué)和western印跡的結(jié)果一致（圖4）。
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Fig.4 Western blot analysis ofcomparative proteomics data. Equal amounts (30 μg for each lane) oftotal bacterial cell proteins were separated on a 12% SDS-PAGE gel,then subjected to western blotting. From left to right the lanes wereloaded with SS2-1 and Δstk samples. Differentially expressed OppA(66 kDa, the first line), DnaJ (41 kDa, the second line) and EF-Tu(44 kDa, the last line) proteins were analyzed using their respectiveantibodies. The CBB-R250-stained gel was used as a loading control.Protein bands were visualized using the ECL substrate
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總之，比較蛋白質(zhì)組分析在突變株Δstk中鑒定了38種下調(diào)的VF，這些VF涉及在SS2感染期間對(duì)宿主細(xì)胞的粘附以及在宿主環(huán)境中的適應(yīng)和存活。先前研究中的表型測(cè)定已經(jīng)證實(shí)Δstk突變株在體外和體內(nèi)的各種應(yīng)激環(huán)境中表現(xiàn)出生長(zhǎng)不足并減弱了致病性。因此，STK對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、應(yīng)激反應(yīng)和SS2 的毒力很重要。