今日最熱朋友圈
湖北省A級(jí)旅游景區(qū)
對(duì)全國(guó)游客免門票開放！
那，“5A級(jí)的實(shí)驗(yàn)直播”要不要？
免費(fèi)觀看！
如果不是全年最____，
怎么會(huì)讓上千萬(wàn)人，擠在一個(gè)頁(yè)面里買東西？
如果不是全程都____，
怎么會(huì)讓科研君們，不買東西也舍不得離開？
如果不是全場(chǎng)發(fā)____，
怎么會(huì)讓各位粉絲，彈幕不停興奮得大呼小叫？
2020年8月11日20:00
金開瑞第三期直播LIVE等你來(lái)！
和往期一樣，在直播開始之前，先來(lái)了解一下我們本場(chǎng)“直播新秀EMSA”。
EMSA技術(shù)簡(jiǎn)介
凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)和DNA相互結(jié)合的技術(shù)，主要研究DNA結(jié)合蛋白與其相關(guān)的DNA相互作用。
實(shí)驗(yàn)原理
基于蛋白-探針復(fù)合物在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。當(dāng)DNA探針與目的蛋白混合孵育時(shí)，目的蛋白可以與末端標(biāo)記的DNA探針結(jié)合，形成DNA探針-蛋白復(fù)合物，電泳時(shí)由于這種復(fù)合物比無(wú)蛋白結(jié)合的探針分子量更大，所以在凝膠中遷移的速度慢，即表現(xiàn)為相對(duì)滯后。
DNA探針-目的蛋白復(fù)合物如果在膜上形成一條滯后條帶，說(shuō)明目的蛋白與DNA探針發(fā)生互作，反之則不結(jié)合。
a) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)說(shuō)明
根據(jù)研究目的合理設(shè)計(jì)特異性探針，還可根據(jù)需求設(shè)計(jì)突變探針或競(jìng)爭(zhēng)性探針實(shí)驗(yàn)。
b) 樣本制備
可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白：總蛋白/核蛋白一般涉及超遷移，需要提供目的蛋白IP級(jí)別抗體；純化好的蛋白則涉及重組表達(dá)，需要考慮目的蛋白重組表達(dá)難度。
c) 探針制備
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成5’端生物素標(biāo)記的引物，退火后形成生物素標(biāo)記的雙鏈DNA探針。
注意事項(xiàng)
a) 重組蛋白：
蛋白盡量上清表達(dá)，且蛋白純度需>80%
b) 核蛋白樣品的制備：
注意用專用的核蛋白抽提試劑來(lái)做，才能使制備的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和構(gòu)像；掌握好核蛋白的濃度和純度，尤其是濃度；蛋白來(lái)源建議選擇細(xì)胞（便于核蛋白提取）。
c) 探針的制備：
建議合成生物素標(biāo)記的引物直接進(jìn)行退火；如果先合成探針再標(biāo)記，可能會(huì)影響標(biāo)記效率。
d) 探針長(zhǎng)度選擇：
目的DNA的長(zhǎng)度應(yīng)小于300bp，太長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生過多結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致結(jié)果分析困難，還會(huì)產(chǎn)生超級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)而掩蓋結(jié)合部位。建議選用短的寡核苷酸片段（60bp以內(nèi)），這樣可以確定具體的結(jié)合位點(diǎn)。
EMSA技術(shù)案例分析
a) 驗(yàn)證性EMSA（設(shè)計(jì)多個(gè)探針，確定結(jié)合位點(diǎn)）
The EMSA results of binding of AlgR to the rsmX/Y/Z promoter sequence.
From：The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5.
小結(jié)：EMSA設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；同時(shí)驗(yàn)證AlgR蛋白與rsmX/Y/Z三段啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)只有rsmZ+AlgR有滯后條帶。
說(shuō)明：AlgR蛋白可以與rsmZ啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。
b) 驗(yàn)證性EMSA（設(shè)計(jì)WT和MUT探針）
From：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.
小結(jié)：在明確結(jié)合位點(diǎn)的情況下設(shè)計(jì)野生型和突變型DNA探針，EMSA電泳時(shí)野生型DNA探針和純化蛋白結(jié)合的復(fù)合物比無(wú)蛋白結(jié)合的DNA探針在凝膠中泳動(dòng)的速度慢，顯色后出現(xiàn)滯后條帶；而突變型DNA探針則無(wú)滯后條帶。
說(shuō)明：SIHZ24蛋白可以與SIGMP3啟動(dòng)子結(jié)合。
c) 競(jìng)爭(zhēng)性EMSA（設(shè)計(jì)標(biāo)記和未標(biāo)記探針）
From：Manipulation of Light Signal Transduction Factors as a Means of Modifying Steroidal Glycoalkaloids Accumulation in Tomato Leaves.
與探針序列相同，不標(biāo)記修飾基團(tuán)的DN**段稱為冷探針（競(jìng)爭(zhēng)探針）。
作用：冷探針含有和探針相同的DNA序列，會(huì)干擾探針與蛋白的結(jié)合。在電泳圖的相應(yīng)位置處，電泳帶的的信號(hào)減弱或消失。
優(yōu)點(diǎn)：探針和蛋白的結(jié)合未必是特異性結(jié)合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能產(chǎn)生假陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。增加一個(gè)冷探針的干擾實(shí)驗(yàn)，可以排除假陽(yáng)性結(jié)果，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
d) 超遷移EMSA（需要IP級(jí)別抗體）
From：Transcriptional regulation of microRNA-126a by farnesoid X receptor in vitro and in vivo.
小結(jié)：提取核蛋白后EMSA檢測(cè)蛋白FXR與miR-216a啟動(dòng)子結(jié)合情況，由于核蛋白是混合蛋白，所以需要確定目的蛋白FXR則需要加入Anti-FXR進(jìn)一步確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)DNA-蛋白滯后條帶上方出現(xiàn)DNA-蛋白-抗體更滯后的條帶（即超遷移）。
說(shuō)明：核蛋白中與miR-216a啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白是FXR。
理論部分就先介紹到這里了，Get更多EMSA實(shí)驗(yàn)小技巧請(qǐng)鎖定我們的直播間！
純干貨!超多實(shí)驗(yàn)小技巧！
空降神秘大咖、狂撒代金券！
線下實(shí)地展示，線上同步直播！
還有紅包、抽獎(jiǎng)等等等你來(lái)！
關(guān)于這場(chǎng)直播我們的流程如下：
首先
金開瑞平臺(tái)簡(jiǎn)介，神秘嘉賓駕到，現(xiàn)場(chǎng)狂撒現(xiàn)金紅包、大額代金券。
然后
EMSA實(shí)驗(yàn)360度全方位展示，另附技術(shù)支持詳細(xì)解說(shuō)（PS：在實(shí)驗(yàn)間隙我們依舊會(huì)給大家發(fā)放福利的哦）。
最后
EMSA實(shí)驗(yàn)展示結(jié)束后，我們會(huì)根據(jù)彈幕區(qū)的評(píng)論決定下期的“直播主角”。
直播的最后光說(shuō)晚安怎么夠？當(dāng)然要配上紅彤彤的現(xiàn)金紅包了，記得鎖定我們的直播間，也許下個(gè)彈幕錦鯉就是你啦！
