題目：LncBRM initiates YAP1 signalling activation to drive self-renewal of liver cancer stem
cells
期刊：Nature Communications
影響因子：12.124
主要技術(shù)：RNA pull down、RIP、RNA-FISH、CRISPR/Cas9
研究背景
肝癌干細(xì)胞（干細(xì)胞）可能導(dǎo)致高復(fù)發(fā)率和肝細(xì)胞癌（HCC）的異質(zhì)性。然而，肝干細(xì)胞生物學(xué)大部分仍然不明確。通過轉(zhuǎn)錄組的芯片數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)稱為lncBRM的長鏈非編碼RNA(lncRNA)在肝癌干細(xì)胞和HCC腫瘤中是高度表達(dá)的。LncBRM是肝癌干細(xì)胞自我更新維持和腫瘤發(fā)生所必需的。在肝癌干細(xì)胞中，lncBRM與BRM聯(lián)合啟動(dòng)BRG1 / BRM轉(zhuǎn)換，BRG1嵌入BAF復(fù)合體觸發(fā)YAP1信號(hào)的激活。 此外，lncBRM與YAP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)的表達(dá)水平與HCC患者的腫瘤分期呈正相關(guān)。 因此，lncBRM和YAP1信號(hào)有望作為肝癌診斷和潛在藥物靶點(diǎn)的生物標(biāo)志物。
研究思路
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. 作者首先通過成球?qū)嶒?yàn)、Northern、RT-qPCR、RNA-FISH、核質(zhì)分離等檢測(cè)手段，檢測(cè)了LncBRM在肝癌腫瘤組織和Huh7中高表達(dá)及細(xì)胞中的定位。
2. 接著在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，沉默及過表達(dá)LncBRM，然后利用成球?qū)嶒?yàn)、Northern Blot 和裸鼠成瘤等一系列實(shí)驗(yàn)證明了LncBRM與細(xì)胞自我更新存在正調(diào)控。
3. 接著作者研究了lncBRM與蛋白BRM的互作。通過RNA pull down、RIP及EMSA證明LncBRM可以與BRM蛋白結(jié)合，而通過FISH檢測(cè)直觀地看到了LncBRM與BRM蛋白在細(xì)胞內(nèi)的重疊分布。
作者接著進(jìn)一步通過IP（Co-IP）及WB等檢測(cè)手段發(fā)現(xiàn)LncBRM與BRM結(jié)合將促使BRM/BRG1轉(zhuǎn)換；而一系列不同濃度shLncBRM的處理，進(jìn)一步證明LncBRM與BRM聯(lián)合啟動(dòng)BRG1/BRM交換。
4. 作者接著運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建BRM KO株和BRG1 KO株，RT-qPCR檢測(cè)多個(gè)基因水平的變化情況，其中YAP1差異最為明顯；進(jìn)而結(jié)合WB蛋白水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BRG1影響YAP1蛋白的表達(dá)。最后通過ChIP、雙熒光素酶、EMSA等手段確定BRG1是影響YAP1表達(dá)的關(guān)鍵因素。
5. 作者先通過Anti-KLF4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)KLF4可以與BRG1結(jié)合，再通過ChIP、EMSA證明KLF4又可以與YAP1啟動(dòng)子結(jié)合。而CRISPR/Cas9技術(shù)基因敲除KLF4及突變YAP1啟動(dòng)子后，再綜合進(jìn)行ChIP、RT-qPCR和WB驗(yàn)證，證明KLF4是直接影響YAP1蛋白表達(dá)。
6. 作者進(jìn)一步通過成球?qū)嶒?yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)再次確認(rèn)YAP1是肝癌干細(xì)胞自我更新和腫瘤增殖所必須的。
?
7. 臨床數(shù)據(jù)分析和標(biāo)本檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證表明lncBRM與YAP1靶標(biāo)的表達(dá)水平與HCC患者的腫瘤嚴(yán)重程度和預(yù)后呈正相關(guān)。
解析文獻(xiàn)
Pingping Zhu,Yanying Wang,et al. LncBRM initiates YAP1 signalling activation to drive self-renewal of liver cancer stem cells.Nature Communications.2016; DOI: 10.1038/ncomms13608
參考文獻(xiàn)
1. Bruix, J., Gores, G. J. & Mazzaferro, V. Hepatocellular carcinoma: clinical frontiers and perspectives. Gut. 63, 844–855 (2014).
2. Visvader, J. E. & Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell 10, 717–728 (2012).
3. Kreso, A. & Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell 14, 275–291 (2014).
4. Chen, Z. et al. Enhanced sensitivity of cancer stem cells to chemotherapy using functionalized mesoporous silica nanoparticles. Mol. Pharm. 13, 2749–2759 (2016).
?
?
金開瑞為您提供RNA pull down、RIP、CRISPR/Cas9等技術(shù)服務(wù)，助力您的科學(xué)研究。