題目：WDR45 contributes to neurodegeneration through regulation of ER homeostasis and neuronal death
期刊：Autophagy
影響因子：11.05
主要技術(shù)： CRISPAR-Cas9、WB、IHC、TMT蛋白組學(xué) 、PRM蛋白靶向驗(yàn)證
研究背景
宏自噬是降解受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集體的主要細(xì)胞分解代謝過程。在人類中，在自噬的多個(gè)步驟中起作用的各種基因的突變可引起廣泛的神經(jīng)退行性疾病。小鼠WDR45神經(jīng)元特異性敲除可導(dǎo)致自噬和軸突變性功能障礙，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性差和學(xué)習(xí)記憶障礙。因此，WDR45的主要功能是調(diào)節(jié)自噬體的形成，其功能的喪失會(huì)導(dǎo)致小鼠行為異常。但WDR45的喪失如何導(dǎo)致BPAN中的神經(jīng)變性的機(jī)制仍不清楚。為了解決這些問題，本文作者構(gòu)建了WDR45敲除小鼠來模擬BPAN病變的復(fù)雜過程，并且利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和一系列細(xì)胞水平的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來闡明BPAN樣病理變化的分子機(jī)制。
技術(shù)路線
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.WDR45基因敲除小鼠顯示認(rèn)知障礙
首先作者利用CRISPAR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了WDR45基因敲除小鼠。
圖1-1 成功構(gòu)建WDR45基因敲除小鼠
接下來作者利用6月齡野生型小鼠和WDR45基因敲除小鼠進(jìn)行了一系列的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、8臂迷宮試驗(yàn)、條件性恐懼實(shí)驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)、三箱社交實(shí)驗(yàn)、Pilocarpine誘發(fā)癲癇實(shí)驗(yàn)等。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)月齡的WDR45 敲除小鼠在運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)方面沒有明顯損害的跡象，但是在空間學(xué)習(xí)和條件記憶方面存在認(rèn)知障礙。另外，與野生型小鼠相比，KO小鼠表現(xiàn)出明顯地更短的潛伏期和更嚴(yán)重的癲癇發(fā)作。
圖1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，顯示W(wǎng)DR45基因敲除小鼠具有認(rèn)知障礙
2.WDR45基因敲除小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元丟失
由于BPAN患者成年后表現(xiàn)為神經(jīng)變性病和帕金森病，因此作者利用免疫組化（IHC）和TUNEL染色等方法檢查了老年小鼠是否有神經(jīng)變性的跡象。結(jié)果表明：WDR45敲除小鼠在老年時(shí)在前額葉皮質(zhì)和黑質(zhì)中表現(xiàn)出神經(jīng)元丟失。
圖2 WDR45敲除小鼠在老年時(shí)在前額葉皮質(zhì)和黑質(zhì)中表現(xiàn)出神經(jīng)元丟失
3.腦組織定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）蛋白在基因敲除小鼠腦中的積累
作者設(shè)計(jì)了3個(gè)10標(biāo)TMT定量蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)，分別研究了5對(duì)野生型（WT）小鼠和敲除（KO)小鼠的大腦前額葉皮層（PFC）、海馬（HIP）和中腦（MIB）組織的差異定量蛋白組學(xué)。共定量到近4000個(gè)蛋白，以FC>1.5，P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，在PFC、HIP和HIP組織中分別篩選到67、12、185個(gè)顯著差異蛋白，其中PFC和MIB共有30個(gè)顯著差異蛋白，HIP和MIB共有4個(gè)顯著差異蛋白。定量結(jié)果的主成分分析表明，兩種基因型在不同腦區(qū)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜是完全分離的。這些結(jié)果說明利用質(zhì)譜定量的方法能夠通過WDR45的缺失來區(qū)分小鼠腦組織蛋白質(zhì)組。
圖3 WT和KO小鼠腦組織蛋白質(zhì)組定量分析
另外，生信分析結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）蛋白在基因敲除小鼠腦中積累最為顯著，其次是脂質(zhì)代謝過程和內(nèi)膜系統(tǒng)組織。
圖4 生物信息學(xué)分析顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）蛋白在WDR45 KO小鼠體內(nèi)積累
4.WDR45通過蛋白酶體和溶酶體途徑調(diào)節(jié)靶ER蛋白
接下來，作者研究WDR45如何調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的水平。首先，Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)WDR45 KO小鼠中腦內(nèi)源性SEC22B顯著上調(diào)，與質(zhì)譜定量結(jié)果趨勢(shì)一致。然后，作者在存在或缺乏BAFA1（一種阻止自噬體溶酶體融合的自噬抑制劑）或MG132（一種蛋白酶體抑制劑）的情況下共表達(dá)WDR45和4個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，結(jié)果表明，BAFA1可有效地阻斷WDR45介導(dǎo)的SEC22B降解，而BAFA1和 MG132均可阻斷WDR45介導(dǎo)的BCAP31降解。而對(duì)照組，只有MG132對(duì)GFP的穩(wěn)定性有輕微影響。這些不同的作用結(jié)果表明，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不同部位的蛋白質(zhì)被不同的機(jī)制降解。此外，在細(xì)胞中通過shRNA敲低WDR45，與敲低Scrbl 相比，所有四種ER蛋白質(zhì)在sh-WDR45的細(xì)胞都有積累，與KO小鼠腦中觀察到的效果類似。這些結(jié)果表明WDR45對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白亞群的穩(wěn)定性有負(fù)面影響。
圖5 WDR45介導(dǎo)靶標(biāo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）蛋白的降解
5.WDR45缺失細(xì)胞可導(dǎo)致ER擴(kuò)增，增加ER應(yīng)激
隨后，作者研究了ER蛋白的積累是否與ER面積的擴(kuò)大相關(guān)。通過標(biāo)記內(nèi)源性ER蛋白CALR（calreticulin），shRNA敲低WDR45與與敲低sh-SCRBL的細(xì)胞相比，顯示出明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。此外，使用衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致外源WDR45被聚集到WT的ER中，而在WDR45缺失細(xì)胞沒有這種現(xiàn)象。免疫熒光分析結(jié)果表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，在WT皮質(zhì)神經(jīng)元的溶酶體（紅色）中積累了CALR蛋白（綠色），表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的溶酶體降解需要WDR45。為了驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的這種作用是否是細(xì)胞器特異性，作者用羰基*化物間氯苯腙（CCCP）處理細(xì)胞來破壞線粒體膜電位。對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)CCCP處理24小時(shí)后，PRKN染色明顯減少，線粒體明顯萎縮，提示PRKN介導(dǎo)了細(xì)胞的有絲分裂。然而，在敲低表達(dá)sh-WDR45的細(xì)胞中，線粒體明顯增大。最后，對(duì)小鼠黑質(zhì)的透射電鏡分析顯示KO小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管增大。因此，作者證明了宏自噬的缺陷導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體這兩個(gè)獨(dú)立細(xì)胞器的自噬缺陷。
此外，作者發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可進(jìn)一步促進(jìn)ER伴侶蛋白HSPA5的表達(dá)。在KO小鼠的原代神經(jīng)元中，作者還發(fā)現(xiàn)HSPA5表達(dá)增加，ERN1/IRE1激活，XBP1選擇性剪接增加。
圖6 WDR 45缺失細(xì)胞表現(xiàn)為ER應(yīng)激增加，ER面積增加
6.WDR 45缺失導(dǎo)致ER應(yīng)激后細(xì)胞死亡增加
接下來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在WDR45缺失的原代神經(jīng)元中，ER標(biāo)記的Calr水平升高，自噬受體SQSTM1積累，LC3-II:LC3-I比率降低。作者利用western blot和免疫組化的方法對(duì)小鼠腦中以SQSTM1積累為特征的自噬缺陷和LC3-II：LC3-I水平降低，以HSPA5，DDIT3 / CHOP為特征的ER應(yīng)激增加以及ERN1 / IRE1途徑的激活，以及最終增加的細(xì)胞凋亡進(jìn)行了重新描述。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以CASP12的斷裂為特征，在16個(gè)月齡時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)WDR45 KO小鼠PFC區(qū)CASP12的斷裂增加。但在腦組織中UPR通路的激活存在差異。KO小鼠EIF2A磷酸化增加，提示EIF2AK3活化，ERN1/IRE1磷酸化和ATF6（N末端）水平變化不顯著。在1月齡的KO小鼠中沒有觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、未折疊蛋白反應(yīng)和凋亡的缺陷，這與衰老是神經(jīng)退行性變的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素的觀點(diǎn)一致。
圖7 WDR 45缺失導(dǎo)致ER應(yīng)激后細(xì)胞死亡增加
7.激活自噬或抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激挽救細(xì)胞凋亡
作者進(jìn)一步猜想是否可以通過調(diào)節(jié)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的藥理挽救。作者使用雷帕霉素（mtor信號(hào)抑制劑）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬可能有助于預(yù)防或減輕神經(jīng)退行性疾病的致病性蛋白聚集。此外，作者還使用了牛磺去氧膽酸（一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，雷帕霉素或牛磺去氧膽酸可減少WDR45缺失細(xì)胞中外源表達(dá)的ER蛋白SEC22B和SEC61B的積累。加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雷帕霉素或牛磺去氧膽酸可減輕WDR45缺陷細(xì)胞的應(yīng)激。同時(shí)雷帕霉素或牛磺去氧膽酸也降低了WDR45缺失細(xì)胞CASP3斷裂的增加。流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)志物ANXA5/ANNEXIN V和7-ADD的結(jié)果表明，雷帕霉素和牛磺去氧膽酸均可減輕tm誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。最令人興奮的是，在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中，tm誘導(dǎo)的自噬活性在KO神經(jīng)元中有缺陷。雷帕霉素和牛磺去氧膽酸可顯著降低KO神經(jīng)元CASP3的裂解。總之，這些數(shù)據(jù)提供了WDR45缺失導(dǎo)致自噬缺陷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制之間的完整聯(lián)系；并提示β-螺旋槳蛋白相關(guān)神經(jīng)變性病的潛在機(jī)制。
圖8 激活自噬或抑制UPR可挽救異常蛋白質(zhì)加工并增加WDR45缺失細(xì)胞的細(xì)胞死亡
小結(jié)
該研究利用CRISPAR-Cas9構(gòu)建了WDR45 基因敲除小鼠，然后利用RT-PCR、PRM分別從基因水平和蛋白水平驗(yàn)證WDR45的敲除效果。一系列動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、8臂迷宮試驗(yàn)、條件性恐懼實(shí)驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)等結(jié)果顯示W(wǎng)DR45基因敲除小鼠具有認(rèn)知障礙。然后作者利用3 x 10標(biāo)TMT實(shí)驗(yàn)從分子層面研究了小鼠大腦組織的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)在基因敲除小鼠中的積累了大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）蛋白。而后作者從細(xì)胞水平上驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)WDR45缺乏可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白積累，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制受損。未折疊蛋白反應(yīng)通過ERN1/IRE1或EIF2AK3/PERK途徑升高，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。通過MTOR抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或激活自噬可減少細(xì)胞死亡。因此，WDR45的缺失會(huì)削弱神經(jīng)元的宏自噬機(jī)制，并導(dǎo)致細(xì)胞器自噬的損傷，提供了對(duì)BPAN病因的機(jī)制性理解和治療這種遺傳性疾病的潛在治療策略。