IF=9.7! 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院團(tuán)隊(duì)：不同電荷聚苯乙烯納米塑料對(duì)斑馬魚的性別特異性神經(jīng)毒性研究
英文標(biāo)題：Life cycle exposure to differentially charged polystyrene nanoplastics leads to gender-specific particle accumulation and neurotoxicity in zebrafish (Danio rerio)
中文標(biāo)題：不同電荷聚苯乙烯納米塑料的全生命周期暴露導(dǎo)致斑馬魚(Danio rerio)出現(xiàn)性別特異性顆粒積累與神經(jīng)毒性
發(fā)表期刊：Environment International
影響因子：9.7
客戶單位：中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院
百趣提供服務(wù)：新一代代謝組學(xué)NGM 2 Pro、AQ700
研究背景
納米塑料(Nanoplastics, NPs)廣泛存在于淡水環(huán)境中，其光降解和物理、化學(xué)分解會(huì)導(dǎo)致塑料表面帶不同的電荷。目前，許多研究側(cè)重于評(píng)估生物體暴露于高濃度NPs后的毒性。在水生環(huán)境中，pH、離子強(qiáng)度和有機(jī)天然物質(zhì)等特性會(huì)顯著影響NPs的聚集。盡管許多研究已經(jīng)調(diào)查了NPs的神經(jīng)毒理學(xué)，但仍然存在大量的研究空白，包括不同電荷的NPs對(duì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的影響。雖然有研究表明不同電荷是影響NPs在生物體內(nèi)積累和神經(jīng)毒性的關(guān)鍵因素，但其在體內(nèi)的潛在影響仍知之甚少。
本研究將斑馬魚(Danio rerio)暴露于與環(huán)境濃度類似的10 μg/L的不同電荷聚苯乙烯(Polystyrene, PS)納米塑料，其中PS不帶電荷，PS-NH2帶正電荷，PS-COOH帶負(fù)電荷。斑馬魚暴露培養(yǎng)120天后，研究人員通過光片顯微鏡三維成像、組織病理學(xué)、基因表達(dá)以及腦組織非靶標(biāo)和靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測(cè)，研究不同電荷NPs對(duì)神經(jīng)毒性、腦損傷和腦代謝的潛在影響。
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研究結(jié)果
2.1 不同電荷PS誘導(dǎo)斑馬魚腦損傷
本部分實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理組，分別為對(duì)照組（CK，即未暴露納米塑料的ISO標(biāo)準(zhǔn)水環(huán)境）、未帶電聚苯乙烯納米塑料組（PS，暴露濃度10 μg/L）、氨基功能化聚苯乙烯納米塑料組（PS-NH2，帶正電，暴露濃度10 μg/L）、羧基功能化聚苯乙烯納米塑料組（PS-COOH，帶負(fù)電，暴露濃度10 μg/L），每組樣本量統(tǒng)一為6尾(n=6)。
將斑馬魚于暴露10 μg/L不同電荷PS培養(yǎng)120天后，研究人員發(fā)現(xiàn)斑馬魚腦發(fā)育的潛力受到抑制。與對(duì)照組相比，暴露于不同電荷PS對(duì)斑馬魚的體重、腦-體指數(shù)、腦損傷都有顯著影響（圖1）。
圖1 斑馬魚生長(zhǎng)情況及腦組織H&E染色的組織學(xué)變化
同時(shí)，研究人員分析了暴露于不同電荷PS對(duì)腦超微結(jié)構(gòu)的潛在影響，發(fā)現(xiàn)暴露于不同電荷PS后，細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)、血腦屏障結(jié)構(gòu)、線粒體結(jié)構(gòu)等均出現(xiàn)損傷（圖2）。
圖2 暴露于不同電荷PS后，雄性和雌性斑馬魚大腦超微結(jié)構(gòu)變化的代表性透射電子顯微鏡圖像
根據(jù)認(rèn)知行為、抑郁樣行為、社會(huì)行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，暴露于不同電荷的NPs對(duì)雌雄斑馬魚的神經(jīng)毒性和認(rèn)知、社交和情感行為也有顯著的影響（圖3）。
圖3 斑馬魚暴露于CK、PS、PS-NH2、PS-COOH后的神經(jīng)行為
基于三維熒光顯微鏡成像，研究人員確定了不同電荷PS在雄性和雌性斑馬魚腦區(qū)的熒光分布（圖4A-B），并繪制了相關(guān)結(jié)構(gòu)示意圖（圖4C）。對(duì)3D影像的統(tǒng)計(jì)分析顯示，雄性和雌性斑馬魚大腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(Reticular Formation, RF)、下丘腦腹側(cè)(ventral hypothalamus, Hv)的熒光強(qiáng)度(Fluorescence Intensity, FI)都發(fā)生了顯著變化（圖4D-E）。雄性斑馬魚大腦中，PS-NH2和PS-COOH聚集在RF結(jié)構(gòu)，而雌性斑馬魚大腦中，僅PS-NH2在RF結(jié)構(gòu)和Hv中檢測(cè)到。這些結(jié)果表明，PS-NH2在斑馬魚大腦的RF和Hv中積累，并導(dǎo)致記憶和抑郁樣行為的異常表現(xiàn)。
10 μg/L PS或10 μg/L PS-COOH處理的雌性斑馬魚，其埃文斯藍(lán)染料(Evans Blue Dye, EBD)外滲明顯高于對(duì)照組，表明血腦屏障通透性明顯增加，結(jié)構(gòu)和完整性均受到干擾（圖4F-G）。然而，不同電荷的PS似乎并沒有直接干擾雄性斑馬魚血腦屏障的完整性。
圖4 與對(duì)照組相比，不同電荷PS處理組的腦部三維熒光成像及血腦屏障通透性
雄性和雌性斑馬魚腦組織中神經(jīng)炎癥因子和神經(jīng)形成的相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平如圖5所示。與對(duì)照組相比，暴露于不同電荷PS對(duì)編碼生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP)、腫瘤壞死因子(TNFa)和白細(xì)胞介素-13(IL-13)等基因表達(dá)水平有顯著影響。其中Mafbb的異常表達(dá)可能導(dǎo)致大腦出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。
圖5 不同電荷PS暴露后雄性(A)和雌性(B)斑馬魚腦中神經(jīng)炎癥因子和神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)水平
2.2 斑馬魚大腦的非靶標(biāo)代謝組結(jié)果
考慮到線粒體功能的重要性，研究人員通過非靶標(biāo)代謝組學(xué)和靶標(biāo)代謝組學(xué)確定可能受到影響的代謝途徑，確定不同電荷PS對(duì)全身代謝穩(wěn)態(tài)的毒性機(jī)制，并進(jìn)一步了解對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)影響。
非靶標(biāo)代謝組結(jié)果顯示，雄性斑馬魚大腦中，與對(duì)照或PS相比，暴露于不同電荷PS的代謝物發(fā)生顯著變化（圖6A-E）。
圖6 雄性斑馬魚大腦非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析
為了進(jìn)一步了解這些代謝物的變化，對(duì)雄性斑馬魚大腦的差異代謝物進(jìn)行了代謝通路分析（圖7）。與對(duì)照組相比，暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH后，在精氨酸和脯氨酸代謝途徑以及丙氨酸代謝等方面存在明顯差異。維恩圖展示了暴露于不同電荷的PS后代謝途徑的差異（圖7F）。與PS相比，PS-NH2、PS-COOH暴露組表現(xiàn)出不同的代謝途徑。例如，PS-NH2暴露影響泛酸和輔酶A的生物合成、谷胱甘肽代謝和嘧啶代謝，而PS-COOH則影響硫胺素代謝途徑（圖7D-E)。
圖7 雄性斑馬魚大腦非靶標(biāo)代謝組學(xué)通路分析
對(duì)雌性斑馬魚腦組織進(jìn)行了相同的非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，呈現(xiàn)出與雄性斑馬魚相似的代謝物變化模式（圖8）。此外，對(duì)雌性斑馬魚大腦的代謝通路也進(jìn)行了分析，以確定暴露于不同電荷PS影響的關(guān)鍵通路（圖9A-E）。與對(duì)照組相比，氨基酰基-tNRA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等通路有顯著變化（圖9A-C）。與PS組相比，PS-NH2暴露對(duì)D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代謝、硫胺素、花生四烯酸等關(guān)鍵代謝通路產(chǎn)生了獨(dú)特的影響（圖9D）。PS-COOH誘導(dǎo)了與半胱氨酸和甲硫氨酸代謝相關(guān)的通路，組氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等通路發(fā)生了顯著變化（圖9E）。
這些發(fā)現(xiàn)表明，不同電荷NPs暴露擾亂了線粒體中許多重要的生物過程，導(dǎo)致認(rèn)知、情感和社交行為受到顯著影響。
圖8 雌性斑馬魚大腦非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析
圖9 雌性斑馬魚大腦非靶標(biāo)代謝組學(xué)通路分析
3 斑馬魚大腦的靶標(biāo)代謝組結(jié)果
研究人員對(duì)斑馬魚大腦中的510種代謝物進(jìn)行了靶標(biāo)代謝組學(xué)研究。暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH的雄性斑馬魚大腦分析顯示，只有一種代謝物減少：酪氨酸。與PS相比，PS-NH2和PS-COOH均導(dǎo)致羥基脯氨酸水平降低(圖10)。
圖10 靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的雄性斑馬魚差異代謝物火山圖
對(duì)于雌性斑馬魚，暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH后，與對(duì)照組相比，艾托因和酪胺代謝產(chǎn)物水平顯著降低。此外，與PS相比，PS-NH2和PS-COOH暴露導(dǎo)致3-甲基硫丙酸水平顯著降低，肌酸水平顯著升高（圖11）。
靶標(biāo)代謝組學(xué)結(jié)果表明，暴露在不同電荷PS環(huán)境下，斑馬魚大腦表現(xiàn)出許多失調(diào)的途徑，其中一些與氨基酸有很強(qiáng)的聯(lián)系。此外，斑馬魚大腦在暴露于不同電荷的PS后，與對(duì)照組相比存在性別特異性差異，還顯示與PS相比存在電荷特異性差異。
圖11 靶標(biāo)代謝組學(xué)分析的雌性斑馬魚差異代謝物火山圖
研究結(jié)論
總的來說，將斑馬魚暴露于與環(huán)境濃度類似的PS條件下培養(yǎng)120天后，研究人員觀察到不同電荷NPs具有電荷特異性和性別特異性反應(yīng)的神經(jīng)毒性。暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH誘導(dǎo)腦和線粒體損傷和炎癥反應(yīng)。暴露于PS-NH2后，雌性斑馬魚大腦中出現(xiàn)了Mafbb、IL-4和IL-13的失調(diào)，RF區(qū)和Hv區(qū)NPs的積累明顯。重要的是，通過非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，這些效應(yīng)與雄性和雌性斑馬魚的不同生物學(xué)途徑有關(guān)。這項(xiàng)工作的發(fā)現(xiàn)增加了對(duì)脊椎動(dòng)物如何在腦損傷和內(nèi)源性代謝方面對(duì)不同電荷的NPs應(yīng)激作出反應(yīng)的理解，并直接為準(zhǔn)確理解這些新出現(xiàn)的污染物對(duì)公眾和環(huán)境健康的風(fēng)險(xiǎn)提供了信息。
新一代代謝組學(xué)NGM 2 Pro：憑借全球領(lǐng)先的2w+代謝物標(biāo)準(zhǔn)品自建庫(kù)，顯著改善代謝組學(xué)鑒定準(zhǔn)確性不足、數(shù)量有限的痛點(diǎn)。其基于LC-MS技術(shù)，可檢測(cè)生物受刺激后小分子代謝物動(dòng)態(tài)變化，助力篩選差異代謝物并關(guān)聯(lián)生理病理。針對(duì)代謝物多樣性及提取局限，該技術(shù)通過多色譜柱聯(lián)用覆蓋非極性/極性代謝物與脂質(zhì)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品自建庫(kù)進(jìn)一步提升鑒定效率，為標(biāo)志物篩選、機(jī)制研究提供有力支撐。
AQ700：是一種高通量靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法，可檢測(cè)15類的600多種代謝物，涵蓋生物體內(nèi)關(guān)鍵代謝通路核心代謝物、腸道菌群相關(guān)代謝物以及文獻(xiàn)中報(bào)道的生物標(biāo)志物。這些代謝物在生理穩(wěn)態(tài)維持、病理機(jī)制調(diào)控等多種健康與疾病狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AQ700采用高靈敏度的三重四極桿質(zhì)譜儀，能夠在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣本中600多種代謝物進(jìn)行精準(zhǔn)、快速的定性與定量分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本代謝譜的全面解析。
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END
張茗心 撰文
Winly 校稿