英文標(biāo)題：Foxp3 confers long-term efficacy of chimeric antigen receptor-T cells via metabolic reprogramming

中文標(biāo)題：Foxp3通過(guò)代謝重編程賦予嵌合抗原受體T細(xì)胞長(zhǎng)期療效

發(fā)表期刊：Cell Metabolism

影響因子：27.7

客戶單位：復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院

百趣提供服務(wù)：經(jīng)典脂質(zhì)組

嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric Antigen Receptor-T, CAR-T)免疫療法在血液癌癥治療中效果顯著，但用于實(shí)體瘤治療時(shí)面臨困境。腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenvironment, TME)的低氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏致使CAR-T細(xì)胞耗竭，限制了治療效果。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T Cells, Tregs)可在TME中生存和發(fā)揮作用，其代謝模式獨(dú)特，F(xiàn)oxp3作為Tregs的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持Tregs代謝和功能意義重大。因此，探究將Tregs代謝優(yōu)勢(shì)引入CAR-T細(xì)胞，借助調(diào)控其代謝來(lái)克服TME障礙、防止細(xì)胞耗竭，有望提升CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤治療中的療效。

1、CAR-T_Foxp3細(xì)胞獲得了與CAR-T_Conv細(xì)胞不同的代謝特征

研究者為探究Foxp3過(guò)表達(dá)對(duì)CAR-T細(xì)胞代謝的影響，選用具有更強(qiáng)擴(kuò)增能力和持久性的第三代CAR。通過(guò)激活健康供體的人T淋巴細(xì)胞，分別用GPC3-CAR感染得到常規(guī)的 GPC3-CAR-T(CAR-T_Conv)細(xì)胞，用GPC3-CAR和Foxp3共同感染培育出GPC3-CAR-T_Foxp3(CAR-T_Foxp3)細(xì)胞（圖1A）。

在檢測(cè)細(xì)胞代謝參數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，GPC3蛋白刺激后，CAR-T_Foxp3細(xì)胞的細(xì)胞外酸化率(Extracellular Acidification Rate, ECAR)和耗氧率(Oxygen Consumption Rate, OCR)低于CAR-T_Conv細(xì)胞（圖1B）。利用LC-MS評(píng)估[U-C13]葡萄糖和[U-C13]谷氨酰胺代謝通量，結(jié)果顯示，CAR-T_Foxp3細(xì)胞從[U-C13]葡萄糖產(chǎn)生的相關(guān)代謝產(chǎn)物低于CAR-T_Conv細(xì)胞，且谷氨酰胺進(jìn)入三羧酸(Tricarboxylic Acid, TCA)循環(huán)的量減少，相關(guān)代謝產(chǎn)物水平也更低（圖1C-F）。添加丙酮酸也無(wú)法恢復(fù)CAR-T_Foxp3細(xì)胞降低的ECAR和OCR。同時(shí)，CAR-T_Foxp3細(xì)胞內(nèi)ATP水平更低，NAD/NADH比值更高，表明其糖酵解和氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)適度下調(diào)（圖1G）。

進(jìn)一步利用非靶LC-MS篩選，發(fā)現(xiàn)CAR-T_Foxp3細(xì)胞中與脂質(zhì)和氨基酸代謝相關(guān)的代謝物表達(dá)有差異，涉及甘油磷脂代謝等多條途徑。脂質(zhì)組學(xué)及BODIPY染色證實(shí)，CAR-T_Foxp3細(xì)胞甘油三酯水平和細(xì)胞內(nèi)脂滴含量增加（圖1H-I）。用二氯乙酸鈉(Sodium Dichloroacetate, DCA)處理后，CAR-T_Foxp3細(xì)胞脂滴含量降低，暗示Foxp3介導(dǎo)的OXPHOS減少與脂質(zhì)代謝上調(diào)有關(guān)（圖1I）。同時(shí)，CAR-T_Foxp3細(xì)胞線粒體膜電位和質(zhì)量降低，線粒體功能改變（圖1J） 。綜上，CAR-T_Foxp3細(xì)胞的代謝特征與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)相似，與CAR-T_Conv細(xì)胞不同。

2、CAR-T_Foxp3細(xì)胞的代謝特征由Foxp3與Drp1的結(jié)合所決定

研究者探究CAR-T_Foxp3細(xì)胞代謝模式與Foxp3和線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其代謝重編程由Foxp3與Drp1的結(jié)合介導(dǎo)。

探究Foxp3與線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白的相互作用：鑒于CAR-T_Foxp3細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondrial Membrane Potential, MMP)和質(zhì)量改變，研究人員探究Foxp3對(duì)Opa1、Drp1、Mfn1和Mfn2等線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白的作用，以明確其代謝模式的成因。雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)實(shí)驗(yàn)顯示，在HEK293T細(xì)胞中Foxp3僅與Drp1存在相互作用（圖2A），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶下拉(Glutathione S-transferase Pull-down Assay, GST pull-down Assay)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證（圖2B）。構(gòu)建融合蛋白觀察到Drp1 定位于細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)oxp3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布（圖2C），二者在細(xì)胞質(zhì)共定位，此現(xiàn)象經(jīng)HEK293T細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)（圖2D）以及以Tregs為對(duì)照的CAR-T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（圖2E）證實(shí)。

研究Foxp3對(duì)Drp1磷酸化及線粒體的影響：已知Drp1絲氨酸616位點(diǎn)磷酸化促線粒體裂變，637位點(diǎn)磷酸化助融合。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3不影響Drp1表達(dá)及絲氨酸637位點(diǎn)磷酸化，卻顯著降低絲氨酸616位點(diǎn)磷酸化水平（圖2F-M）。利用AlphaFold軟件預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)和對(duì)接結(jié)果表明，絲氨酸616位點(diǎn)磷酸化影響Foxp3與Drp1結(jié)合穩(wěn)定性。顯微鏡觀察顯示，CAR-T_Foxp3細(xì)胞線粒體聚集伸長(zhǎng)且數(shù)量少于CAR-T_Conv細(xì)胞（圖2G-I）。此外，F(xiàn)oxp3對(duì)Drp1上游激酶CDK1和ERK1/2無(wú)明顯抑制作用（圖2M）。綜合這些結(jié)果可知，F(xiàn)oxp3與Drp1結(jié)合可能影響Drp1磷酸化和線粒體裂變，進(jìn)而重編程CAR-T細(xì)胞代謝。

確定Foxp3與Drp1結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)代謝的影響：為確定Foxp3與Drp1結(jié)合位點(diǎn)及其對(duì)代謝的影響，研究人員利用薛定諤軟件進(jìn)行對(duì)接研究，篩選出5個(gè)結(jié)合穩(wěn)定性最高的構(gòu)象。通過(guò)構(gòu)建多種Foxp3序列部分缺失質(zhì)粒，BiFC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺失340-390位氨基酸片段會(huì)破壞二者相互作用。構(gòu)建缺失該片段的CAR-T_{Foxp3(340-390)}細(xì)胞后，觀察到其融合線粒體消失、線粒體數(shù)量恢復(fù)、脂滴含量降低，線粒體質(zhì)量、MMP、ECAR和OCR增加（圖2G-L），且Drp1絲氨酸616位點(diǎn)磷酸化增強(qiáng)（圖2M）。研究還預(yù)測(cè)Foxp3的340-390片段與Drp1的600-620片段結(jié)合，構(gòu)建缺失600-620片段的Drp1變體后，其BiFC平均熒光強(qiáng)度顯著降低，表明該片段參與二者相互作用，解釋了Drp1絲氨酸616位點(diǎn)磷酸化下調(diào)的原因（詳情可查閱補(bǔ)充材料）。

綜上，CAR-T_Foxp3細(xì)胞代謝重編程由Foxp3與Drp1結(jié)合介導(dǎo)。

3、CAR-TFoxp3細(xì)胞不會(huì)獲得Tregs的染色質(zhì)可及性和抑制功能

染色質(zhì)可及性分析：研究人員利用ATAC-seq技術(shù)分析Tregs、CAR-T_Conv和CAR-T_Foxp3細(xì)胞全基因組染色質(zhì)可及性，發(fā)現(xiàn)ATAC-seq峰主要集中于啟動(dòng)子、內(nèi)含子和遠(yuǎn)端基因間區(qū)域，降維分析可清晰區(qū)分三類細(xì)胞（圖3A）。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)周圍平均ATAC-seq信號(hào)顯示，Tregs讀數(shù)濃度低于其余兩組，而CAR-T_Conv與CAR-T_Foxp3細(xì)胞信號(hào)相近（圖3B）。深入分析發(fā)現(xiàn)，Tregs中顯著升高的峰高度富集于TRPS1、RUNX2等轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別基序，這些基序與Tregs的抑制功能相關(guān)。然而，在CAR-T_Foxp3細(xì)胞中，這些基序并不富集，表明二者染色質(zhì)格局存在差異（圖3C-E）。

細(xì)胞因子與標(biāo)志物檢測(cè)：檢測(cè)T細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物和細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，與Tregs相比，CAR-T_Foxp3細(xì)胞分泌的IL-10、TGF-β水平較低，CTLA-4抑制性受體表達(dá)也降低，且與CAR-T_Conv細(xì)胞情況相近（圖3F）。GPC3抗原刺激后，CAR-T_Foxp3、CAR-T_Conv和Tregs細(xì)胞中CD39和CD73表達(dá)無(wú)顯著差異（圖3F）。

抑制功能驗(yàn)證：通過(guò)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CAR-T_Foxp3細(xì)胞對(duì)T_Conv細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示CAR-T_Foxp3組中T_Conv細(xì)胞增殖明顯強(qiáng)于Tregs組，與CAR-T_Conv組相近，表明CAR-T_Foxp3細(xì)胞無(wú)抑制作用。

差異峰與代謝物分析：研究發(fā)現(xiàn)，在CAR-T_Foxp3細(xì)胞上調(diào)、CAR-T_Conv細(xì)胞下調(diào)的峰中，僅有少量能在Tregs中共同富集（圖3G-H）。通路富集分析表明這些峰集中于細(xì)胞代謝過(guò)程（圖3I）。質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CAR-T_Foxp3細(xì)胞中乳酸、富馬酸和NADH水平顯著低于CAR-T_Conv細(xì)胞，或可解釋CAR-T_Foxp3細(xì)胞染色質(zhì)可及性與代謝相關(guān)的變化。

綜上，CAR-T_Foxp3細(xì)胞在染色質(zhì)格局和抑制功能上與Tregs存在根本差異，不會(huì)轉(zhuǎn)化為Tregs。

4、Foxp3介導(dǎo)的代謝下調(diào)了CAR-T_Foxp3細(xì)胞中與耗竭相關(guān)的抑制性分子的表達(dá)

接下來(lái)，研究者探究了Foxp3介導(dǎo)的代謝對(duì)CAR-T_Foxp3細(xì)胞活化和功能的影響。

細(xì)胞表型與功能檢測(cè)：將CAR-T_Foxp3和CAR-T_Conv細(xì)胞與GPC3⁺Huh7腫瘤細(xì)胞孵育72小時(shí)后，CAR-T_Foxp3細(xì)胞的CD27、CD28等活化及表型標(biāo)志物和BCL-6轉(zhuǎn)錄因子水平更高，CD95、EOMES等水平更低（圖4A-B）。細(xì)胞毒性評(píng)估表明，CAR-T_Foxp3細(xì)胞與CAR-T_Conv細(xì)胞殺傷能力相似（圖4C） ，但前者釋放的顆粒酶B、IFN-γ等細(xì)胞因子更少（圖4D）。

耗竭標(biāo)志物分析：GPC3抗原刺激72小時(shí)后，CAR-T_Foxp3細(xì)胞中PD-1、LAG-3等耗竭標(biāo)志物表達(dá)及三重/雙重陽(yáng)性比例均低于CAR-T_Conv細(xì)胞（圖4E-F）；經(jīng)三輪抗原刺激后，第12天時(shí)CAR-T_Foxp3細(xì)胞耗竭分子減少、干細(xì)胞標(biāo)志物CD62L增加，而CAR-T_{Foxp3(340–390)}細(xì)胞未維持該優(yōu)勢(shì)（圖4G）。

機(jī)制探究：用P110處理增加Drp1絲氨酸616位點(diǎn)磷酸化后，CAR-T_Foxp3細(xì)胞耗竭標(biāo)志物顯著上升，CAR-T_Conv細(xì)胞無(wú)變化（圖4H）；DCA處理或抑制脂肪酸β氧化，僅使CAR-T_Foxp3細(xì)胞耗竭標(biāo)志物表達(dá)增加（圖4I）。表明Foxp3與Drp1的相互作用、p-Drp1受損及Foxp3介導(dǎo)的代謝模式，共同作用下調(diào)CAR-T_Foxp3細(xì)胞耗竭標(biāo)志物。

綜上，F(xiàn)oxp3介導(dǎo)的代謝不影響CAR-T_Foxp3細(xì)胞毒性，但可下調(diào)其與耗竭相關(guān)的抑制性分子表達(dá)，對(duì)細(xì)胞功能調(diào)控具有重要意義。

5、CAR-T_Foxp3細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性，且耗竭標(biāo)志物水平降低

通過(guò)小鼠皮下異種移植瘤模型及后續(xù)分子檢測(cè)，證實(shí)CAR-T_Foxp3細(xì)胞在體內(nèi)抗腫瘤能力更強(qiáng)且耗竭程度更低。

體內(nèi)抗腫瘤效果驗(yàn)證：構(gòu)建小鼠皮下腫瘤模型，在腫瘤體積約100mm³時(shí)（圖5A），注射不同T細(xì)胞。結(jié)果顯示，CAR-T_Foxp3細(xì)胞治療組腫瘤生長(zhǎng)最慢（圖5B-C），腫瘤重量更輕（圖5D），表明其具有更強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性 。

細(xì)胞表型與功能分析：第20天對(duì)腫瘤組織進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與CAR-T_Conv細(xì)胞相比，CAR-T_Foxp3細(xì)胞CD28表達(dá)顯著增加，PD-1、LAG-3、TIM-3等耗竭標(biāo)志物明顯降低（圖5E-G），三重或雙重陽(yáng)性率也大幅下降（圖5F）；共聚焦免疫熒光分析顯示，CAR-T_Foxp3細(xì)胞中PD-1與CD3積分密度比值更低（圖5H-I），進(jìn)一步說(shuō)明其耗竭程度低。

轉(zhuǎn)錄組水平探究：對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq，主成分分析明確區(qū)分CAR-T_Foxp3與CAR-T_Conv細(xì)胞；CAR-T_Foxp3細(xì)胞中Foxp3持續(xù)高表達(dá)，TIM-3等耗竭相關(guān)基因顯著下調(diào)（圖5J），基因集富集分析證實(shí)其耗竭狀態(tài)更低（圖5K）。此外，轉(zhuǎn)錄組分析表明CAR-T_Foxp3細(xì)胞與Tregs存在根本差異，但部分上調(diào)基因在細(xì)胞代謝通路富集，提示二者代謝特征有相似之處（圖5L）；同時(shí)，CAR-T_Foxp3細(xì)胞中線粒體相關(guān)通路顯著富集，且Foxp3靶基因在兩類細(xì)胞中的表達(dá)有差異。

綜上，CAR-T_Foxp3細(xì)胞在體內(nèi)展現(xiàn)出優(yōu)于CAR-T_Conv細(xì)胞的抗腫瘤能力，且耗竭相關(guān)抑制性分子表達(dá)更低，在腫瘤免疫治療中具有潛在優(yōu)勢(shì)。

6、Foxp3在體內(nèi)使CAR-T_Foxp3細(xì)胞維持持久的抗腫瘤效果以及較低水平的耗竭標(biāo)志物

腫瘤再攻擊模型實(shí)驗(yàn)：當(dāng)腫瘤體積達(dá)50mm³時(shí)（圖6A），預(yù)先給予CAR-T細(xì)胞，CAR-T_Foxp3組腫瘤清除速度略快于CAR-T_Conv組（圖6B）。腫瘤清除后，兩組外周血CAR-T細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)差異（圖6C），但CAR-T_Foxp3組初始/干細(xì)胞記憶T細(xì)胞比例更高，終末效應(yīng)記憶T細(xì)胞比例更低（圖6D-E）。第29天再次用腫瘤細(xì)胞攻擊，CAR-T_Foxp3組腫瘤生長(zhǎng)最慢（圖6F）。

驗(yàn)證Foxp3關(guān)鍵作用：將CAR-T_{Foxp3(340–390)}、CAR-T_Foxp3和CAR-T_Conv細(xì)胞注射到荷瘤小鼠（圖6G），初期腫瘤均快速清除（圖6H）。再次攻擊后，CAR-T_{Foxp3(340–390)}組腫瘤生長(zhǎng)速度與CAR-T_Conv組相似且快于CAR-T_Foxp3組（圖6I），其TIM-3和LAG-3比例與CAR-T_Conv組相當(dāng)且高于CAR-T_Foxp3組。

綜上，CAR-T_Foxp3細(xì)胞增強(qiáng)的抗腫瘤效果及較低的耗竭相關(guān)抑制分子水平依賴于Foxp3的第340-390位殘基，證實(shí)了Foxp3在CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性中的關(guān)鍵作用。

7、人源化NSG模型下CAR-TFoxp3細(xì)胞的雙重特性——強(qiáng)抗癌、無(wú)免疫抑制

模型構(gòu)建與細(xì)胞檢測(cè)：使用CD34造血干細(xì)胞構(gòu)建人源化NSG小鼠，在外周血和脾臟中檢測(cè)到多種人類免疫細(xì)胞，外周血中人類免疫細(xì)胞(hCD45⁺)占總免疫細(xì)胞比例超60%，脾臟中人類免疫細(xì)胞占活細(xì)胞比例可達(dá)80%。

抗腫瘤效果：建立皮下異種移植瘤模型并給予不同CAR-T細(xì)胞治療（圖7A），CAR-T_Foxp3細(xì)胞顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，五只小鼠中有兩只完全緩解，其余三只腫瘤大小也明顯減小（圖7B-C）。

細(xì)胞及因子分析：第25天分析顯示，與CAR-T_Conv組相比，CAR-T_Foxp3細(xì)胞耗竭相關(guān)抑制分子（PD-1和LAG-3）水平更低，腫瘤浸潤(rùn)的CD4⁺T細(xì)胞更多（圖7D-F）；兩組腫瘤浸潤(rùn)的人類免疫細(xì)胞組成相似（圖7F），小鼠脾臟重量和重要器官無(wú)顯著差異（圖7E）。多重細(xì)胞因子檢測(cè)表明，CAR-T_Foxp3組中TNF-α和IL-10分泌量更低，細(xì)胞因子水平更穩(wěn)定，IL-1β、IL-4等多種細(xì)胞因子平均水平低于CAR-T_Conv組，提示細(xì)胞因子風(fēng)暴減輕，而對(duì)CAR-T細(xì)胞活化增殖關(guān)鍵的IL-2濃度兩組無(wú)顯著差異（圖7G）。

綜上，CAR-T_Foxp3細(xì)胞在人源化NSG模型中展現(xiàn)出增強(qiáng)的抗腫瘤活性，同時(shí)維持安全性，未誘導(dǎo)免疫抑制。

本研究圍繞CAR-T_Foxp3細(xì)胞的抗腫瘤作用展開(kāi)深入探究。通過(guò)構(gòu)建小鼠皮下異種移植瘤模型、腫瘤再攻擊模型以及人源化NSG小鼠模型，從多維度驗(yàn)證了CAR-T_Foxp3細(xì)胞的特性。在小鼠皮下異種移植瘤模型中，CAR-T_Foxp3細(xì)胞腫瘤抑制效果顯著，細(xì)胞耗竭程度低，且在轉(zhuǎn)錄組水平展現(xiàn)出獨(dú)特的基因表達(dá)模式。腫瘤再攻擊模型證實(shí)其抗腫瘤作用的持久性，且該效果依賴于Foxp3的第340-390位殘基。在人源化NSG模型中，CAR-T_Foxp3細(xì)胞不僅能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)部分小鼠腫瘤完全緩解，還能維持較低的耗竭標(biāo)志物水平，減輕細(xì)胞因子風(fēng)暴 ，且不誘導(dǎo)免疫抑制，同時(shí)對(duì)其他免疫細(xì)胞組成及小鼠重要器官無(wú)不良影響。這些結(jié)果表明，CAR-T_Foxp3細(xì)胞在體內(nèi)具有優(yōu)異的抗腫瘤活性和良好的安全性，為腫瘤免疫治療提供了新的潛在策略和理論依據(jù)。